Введение

Реакции лекарственной гиперчувствительности (ЛГ) являются важной проблемой общественного здоровья из-за их потенциальной опасности вызывать жизнеугрожающую анафилаксию, а также тяжелые кожные нежелательные реакции (SCAR – severe cutaneous adverse reactions). ЛГ может быть вызвана иммунологически опосредованными реакциями (называемыми лекарственными аллергиями), а также прямыми неаллергическими, опосредованными мастоцитами лекарственными реакциями. Иммунологические реакции в соответствии с классификацией по Джеллу и Кумбсу подразделяются на четыре категории: реакции I типа (характеризуются немедленным – через несколько минут после поступления аллергена в организм – началом) опосредованы взаимодействием иммуноглобулинов Е (IgЕ) с рецепторами тучных клеток и базофилов; реакции II типа – цитотоксические, вызваны антитело (обычно IgG)-опосредованным разрушением клеток; реакции III типа (развиваются при накоплении в крови или тканях иммунных комплексов «лекарство-IgG» и активации комплемента) и реакции IV типа, которые характеризуются замедленным началом и опосредованы Т-клетками [1]. По данным Всемирной аллергологической организации (WAO – World Allergy Organization), реакции ЛГ также можно группировать на немедленные и замедленные реакции в зависимости от сроков появления симптомов [2].

Реакции немедленного типа обычно развиваются в течение нескольких минут или часов после воздействия препарата. Диапазон клинических проявлений варьируется от зуда, крапивницы, ангиодистрофии и бронхоспазма до анафилаксии. Реакции I типа требуют наличия специфического для лекарственного препарата IgE, который образует гаптеновый комплекс. Специфический IgE продуцируется при первом воздействии антигена (лекарственного препарата), а затем он связывается с высокоаффинным Fc-рецептором на поверхности базофилов или тучных клеток. При повторном воздействии того же препарата происходит связывание двух или более молекул IgE на поверхности базофилов или тучных клеток с одной поливалентной молекулой антигена, что инициирует серию событий клеточной активации. Эта активация вызывает внеклеточное высвобождение гранул с преформированными воспалительными медиаторами, включая гистамин, лейкотриены, простагландины, гепарин и другие цитокины [3]. IgE-опосредованная иммунологическая лекарственная аллергия представляет собой меньшую по сравнению с неиммунологической часть лекарственной гиперчувствительности [4]. Согласно системе классификации WAO, иммунологическая анафилаксия может быть вызвана IgE-опосредованным или не-IgE-опосредованным механизмами, тогда как неиммунологическая анафилаксия включает непосредственную активацию тучной клетки [2]. Несмотря на различия в основных механизмах, клинические симптомы обоих типов анафилаксии схожи и часто неразличимы.

Реакции замедленного типа состоят в основном из IV типа, которые опосредованы Т-клетками и характеризуются замедленным началом развития (через несколько дней или даже недель после воздействия препарата). Клинические проявления варьируются от мягких макулопапулезных экзантем (MPE – mild maculopapular exanthema), контактного дерматита, хронического аллергического ринита, хронической астмы, нефрита, гепатита и фиксированной лекарственной эритемы (FDE – fixed drug eruptions) до угрожающей жизни SCAR. Развитие SCAR характерно для синдрома DRESS/DISH (drug-induced hypersensitivity syndrome), синдрома Стивенса–Джонсона (SJS), токсического эпидермального некролиза (TENs) и острого генерализованного экзантематического пустулеза (AGEP – acute generalized exanthematous pustulosis) [5].

Если фенотип MPE состоит из самоограниченных диффузных эритематозных макул и папул без системного участия, то синдром DRESS/DISH характеризуется типичными кожными высыпаниями (например, эксфолиативный дерматит и генерализованная макулопапулезная экзантема), лихорадкой, атипичным лимфоцитозом, эозинофилией, лимфаденопатией и системным поражением (например, участием печени и почек). Для синдромов SJS и TEN (SJS/TEN) типично быстрое развитие пузырчатых экзантем, пурпурных пятен и мишенеподобных поражений с вовлечением слизистой оболочки и отслоением кожи: при SJS – до 10% площади кожи, промежуточной или переходной (overlapping) SJS-TEN форме – 10–29% и при TEN – более 30% площади кожи [6, 7]. Между тем AGEP, как правило, представляет собой внезапное высыпание малых нефолликулярных пустул на фоне эритемы с системным участием, включая лихорадку и нейтрофилию [8].

Большинство форм ЛГ включает Т-клеточные иммунные реакции против конкретного лекарственного средства/пептида антигенов, что приводит к различным клиническим фенотипам. Т-клеточный рецептор (TCR – T-cell receptor), CD4+-, и CD8+-Т-клетки участвуют в различных реакциях ЛГ замедленного типа [9]. Молекулярные механизмы и контрольные точки для реакций ЛГ включают активацию Т-клеток и иммунные ответы, цитотоксические белки и секрецию цитокинов/хемокинов, специфические клонотипы TCR, нарушения метаболизма или клиренса лекарственного средства (например, сильная связь цитохрома Р-450 семейства 2 подсемейства C члена 9*3 (CYP2C9*3) с индуцированным фенитоином SCAR] и механизмы гибели клеток (например, miR-18a-5p-индуцированный апоптоз, а также аннексин A1 и формил-пептидный рецептор 1-индуцированный некроптоз в кератиноцитах). Кроме того, генетические полиморфизмы и специфические HLA-локусы также играют важную роль, например HLA-B*15:02 – для карбамазепин (CBZ-)-индуцированного синдрома SJS/TEN; HLA-B*58:01 – для индуцированного аллопуринолом SCAR и HLA-B*57:01 – для абакавир-индуцированных реакций гиперчувствительности. Более того, сообщается, что с восприимчивостью к ЛГ также связаны факторы окружающей среды, аутоиммунные нарушения и отягощенный анамнез пациента по вирусной инфекции.

Молекулярные механизмы развития ЛГ

Презентация и процессинг антигена. Концепции, объясняющие механизмы развития ЛГ. Лекарства считаются чужеродными антигенами и связываются с комплексом HLA/пептид/TCR, чтобы вызвать иммунные реакции гиперчувствительности. Существует 4 гипотезы относительно механизмов представления лекарств, предложенных для объяснения того, как небольшие лекарственные антигены могут взаимодействовать с HLA и TCR при лекарственной гиперчувствительности: 1) теория гаптена; 2) концепция фармакологического взаимодействия с иммунными рецепторами «p-i» (pharmacological interaction with immune receptors); 3) модель измененного репертуара пептидов; 4) модель измененного репертуара TCR [10–15].

Гаптенная теория постулирует, что причинно-значимые лекарства или их реактивные метаболиты слишком малы, чтобы быть иммуногенными сами по себе, поэтому они ковалентно связываются с эндогенными пептидами с образованием антигенного комплекса «гаптен–носитель». Комплекс гаптен-носитель представляется молекуле HLA и затем распознается TCR, что приводит к индукции специфических для лекарств клеточных или гуморальных иммунных реакций. Гаптенная теория была доказана при индуцированной пенициллином кожной побочной лекарственной реакции (cADR – cutaneous adverse drug reaction) [10, 16].

Вторая альтернативная концепция «фармакологического взаимодействия» с иммунными рецепторами (p-i) постулирует, что препараты могут непосредственно, обратимо и нековалентно связываться с белком HLA и/или TCR и таким образом обходить классический путь процессинга антигена в антигенпредставляющих клетках. C.Y. Wei et al. ранее обнаружили, что CBZ/ароматические противоэпилептические препараты могут напрямую взаимодействовать с белком HLA-B*15:02 [11]. Никакой процессинг внутриклеточного антигена или метаболизм лекарственного средства не был задействован при HLA-B*15:02 представлении CBZ [11]. Оксипуринол, реактивный метаболит аллопуринола, демонстрирует другой пример концепции p-i, заключающийся в том, что он может непосредственно и сразу активировать специфичные для лекарственного средства Т-клетки посредством преимущественного использования HLA-B*58:01 без внутриклеточной обработки [12].

Третья модель измененного пептидного репертуара утверждает, что «ответственные» лекарства в связывании с пептидом занимают позицию в канавке белка HLA, изменяя антигенсвязывающую щель и пептидную специфичность связывания HLA. Было показано, что абакавир-индуцированная гиперчувствительность относится к этой модели, поскольку кристаллическая структура HLA-B*57:01 образует комплексы с абакавиром и пептидами [13, 14].

Эти исследования показали, что абакавир связывается с F-карманом HLA-B*57:01, модифицирует форму и химию антигенсвязывающей щели, тем самым изменяя репертуар эндогенных пептидов и приводя к поликлональной Т-клеточной активации и аутоиммуноподобным проявлениям системной реакции.

Наконец, модель измененного репертуара TCR предполагает, что некоторые препараты, такие как сульфаметоксазол, взаимодействуют не с пептидами или молекулами HLA, а непосредственно с TCR. Антигены лекарственного препарата связываются с определенными TCR и изменяют их конформацию, что дает им возможность связываться с комплексами «HLA-аутологичный пептид» для развития иммунных реакций [17]. На этой модели TCR рассматривается в качестве исходной молекулы взаимодействия с лекарством и тем самым дается понять, что TCR в возникновении ЛГ имеет столь же большое значение, как и HLA. Кроме того, вирусы также могут участвовать во взаимодействиях HLA/лекарства/TCR и играть важную роль в развитии ЛГ, обеспечивая поставку экзогенных пептидов для предоставления лекарственного препарата [16].

Клеточная иммунология и иммунные молекулы, участвующие в реакции ЛГ

ЛГ немедленного типа. Немедленная ЛГ может быть вызвана IgE-опосредованным или не-IgE-опосредованными механизмами [18]. IgE-опосредованные механизмы опосредуются лекарственно-специфическими IgE через иммунный ответ на комплекс гаптен/носитель. При первичной лекарственной сенсибилизации, когда плазматические клетки трансформируются из активированных В-клеток и взаимодействуют с Т-клетками, образуются специфические IgE. Лекарственные аллергены при аллергической реакции взаимодействуют с тучными клетками или базофилами посредством высокоаффинных Fc-рецепторов, с которыми связан специфический IgE, вызывая дегрануляцию тучных клеток или базофилов, что приводит к высвобождению различных медиаторов, таких как гистамин, лейкотриены, простагландины и цитокины [3]. Недавно было выдвинуто предположение, будто дегрануляция происходит в двух основных формах, связанных с тяжестью реакции и с ее прогрессированием: поэтапная дегрануляция и анафилактическая дегрануляция [2, 19]. Поэтапная дегрануляция опосредуется повышением CD203c на базофилах через образование мелких везикул из гистаминсодержащих гранул, быстро перемещающихся к плазменной мембране, чтобы вызвать более серьезные и быстрые реакции [20]. Анафилактическая дегрануляция приводит к слиянию основных гистаминсодержащих гранул с плазменной мембраной, высвобождая все содержимое гранул во внеклеточное пространство и располагая CD63 на поверхности базофилов [20].

Иммунологические механизмы, не связанные с IgE, опосредованы IgG-антителами или активацией комплемента [21, 22]. Установлена IgG-опосредованная анафилаксия на мышиных моделях, где использование лекарств с конкретными IgG, связанными с FcγRIII, стимулировало высвобождение тромбоцитарного фактора (PAF – platelet activating factor) с помощью базофилов, макрофагов или нейтрофилов [22]. Хотя механизм IgG-опосредованной анафилаксии у людей полностью еще не продемонстрирован, некоторые исследования показывают, что PAF является важным посредником в развитии такой анафилаксии [23]. Кроме того, новый вариант сплайсинга FcγRIIA был идентифицирован у пациентов с гипогаммаглобулинемией, у которых развилась анафилаксия после внутривенной инфузии иммуноглобулина [24]. Было также показано, что биологические агенты с IgA и инфликсимабом индуцируют анафилаксию в отсутствие специфического IgE, но при высоких уровнях специфического IgG [25–27]. Эти наблюдения дают некоторые дополнительные доказательства для IgG-опосредованной анафилаксии. Кроме того, было установлено, что дополнительная активация может быть индуцирована в отсутствие агент-специфических иммунокомплексов IgE- или IgG-антител [22]. Такое состояние может наблюдаться у пациентов, подвергнутых гемодиализу с новой диализной мембраной, при нейтрализации гепарина протамином и инфузии полиэтиленгликоля [21, 28]. Препараты, солюбилизированные в терапевтических липосомах, и эксципиенты на основе липидов (такие, как Cremophor EL, используемый в качестве разбавителя для более старых препаратов пропофола и паклитаксела) могут образовывать большие мицеллы с липидами и холестерином сыворотки для стимуляции системы комплемента [21, 28]. Эта активация механизмов комплемента также приводит к высвобождению C3a, C5a и C5b-9, которые в свою очередь стимулируют активацию тучных клеток, базофилов и других клеток через их специфические рецепторы, что приводит к дегрануляции и освобождению медиатора [22].

Реакция гиперчувствительности неиммунологического типа непосредственно активирует дегрануляцию тучных клеток без привлечения активации иммунной системы. Существует несколько конкретных агентов, которые индуцируют различные механизмы, не связанные с прямой иммуноглобулин-опосредованной активацией или активацией комплемента. Так, контаминированный сульфатированным хондроитин сульфатом гепарин, как было установлено, вызывал различные случаи анафилаксии в США в 2007–2008 гг. через прямую активацию кининовой системы с повышением продукции брадикинина, С3а и C5a [29]. В связи с этим следует отметить, что образование брадикинина, опосредованное активацией фактора XII, играет ключевую роль в анафилаксии [22]. Нестероидные противовоспалительные средства (НПВС), включая аспирин, также могут приводить к анафилактическим реакциям посредством ингибирования циклооксигеназы с уменьшением продуцирования простагландинов и повышением генерации цистеинил-лейкотриенов [21]. Ванкомицин может непосредственно активировать тучные клетки и/или базофилы, что приводит к высвобождению гистамина [30]. Предполагалось, что этот механизм опосредуется через зависимую от кальция активацию фосфолипазы-C и фосфолипазы-А2 [30]. Опиаты (например, меперидин, кодеин и морфин) также вызывают высвобождение гистамина через прямую дегрануляцию тучных клеток [31]. Недавно было предположено, что реакции неиммунологической гиперчувствительности могут быть опосредованы через рецептор тучных клеток MRGPRX2 в случаях, связанных с такими конкретными лекарствами, как икатибант, нервно-мышечные блокирующие препараты и хинолоновые антибиотики [32]. Взаимодействие определенных лекарств с этим рецептором тучных клеток может стимулировать дегрануляцию и высвобождение фактора некроза опухоли α (ФНО-α) и простагландина D2 (PgD2) наряду с другими молекулами, приводящими к неиммунологической анафилактической реакции [32]. Мышиный аналог MRGPRX2, участвующий в индуцированных лекарствами пептидергических псевдоаллергических реакциях, был недавно выявлен и может потенциально применяться в доклинических моделях тестирования [32, 33].

ЛГ замедленного типа. Суть основной концепции, объясняющей патомеханизмы ЛГ замедленного типа, состоит в том, что специфические Т-лимфоциты или природные клетки-киллеры (NK cells – natural killer cells) активируются при распознавании антигена или Fas/FasL взаимодействии и высвобождают различные цитотоксические белки, включая перфорин/гранзим B и гранулизин, которые атакуют кератиноциты или другие клетки, вызывая кожную сыпь или эпидермальный некроз. Кроме того, в иммунных реакциях ЛГ принимают участие и некоторые другие цитокины/хемокины, в т.ч. такие, как ФНО-α, интерферон-γ (ИФН-γ), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ), TARC (thymus and activation-regulated chemokine)/CCL17, интерлейкин-6 (ИЛ-6), ИЛ-8/CXCL8, ИЛ-15 и ИЛ-36. Было показано, что указанные цитокины/хемокины имеют высокую экспрессию в кожных поражениях, блистерных жидкостях и клетках, мононуклеарных клетках периферической крови (РВМС – peripheral blood mononuclear cells) или плазме пациентов. Эти иммунные медиаторы, как выяснилось, несут ответственность за направленную миграцию, пролиферацию, регуляцию или активацию Т-лимфоцитов и других лейкоцитов, тем самым влияя на клинические проявления ЛГ различными способами.

Взаимодействие Fas-FasL. Fas-лиганд (FasL) относится к семейству ФНО. Связывание Fas и FasL играет важную роль в регуляции иммунной системы и участвует в апоптозе эпидермальных клеток у пациентов с ЛГ. Короче говоря, при Fas-FasL-взаимодействии ассоциированный с Fas домен смерти (FADD – Fas-associated death domain) рекрутируется и связывается с комплексом Fas-FasL. Затем FADD рекрутирует прокаспазу 8, объединяя вместе несколько копий прокаспазы 8, которые в свою очередь активируются, чтобы стать каспазой 8, запуская каспазный каскад, что приводит к деградации внутриклеточной ДНК [34]. I. Viard et al. полагают, что суицидальное взаимодействие между Fas и FasL, которые экспрессируются на кератиноцитах, приводит к обширному некрозу эпидермальных клеток у индивидуумов с SJS/TEN [35].

Перфорин/Гранзим Б. Альтернативная гипотеза предполагает, что перфорин и гранзим B играют более важную роль в гибели кератиноцитов при SJS/TEN, чем Fas-FasL-взаимодействия [36]. Гранзимы представляют собой сериновые протеазы, которые выделяются цитоплазматическими гранулами и могут индуцировать запрограммированную гибель клеток-мишеней. После активации антиген-специфичные цитотоксические Т-лимфоциты (CTL – cytotoxic T lymphocytes) и NK-клетки продуцируют перфорин, способный связывать и пробивать канал через клеточную мембрану, содействуя проникновению гранзима B в клетки-мишени, чтобы активировать каспазный каскад и последующий апоптоз [37]. Реакции замедленного типа на лекарства показали, что увеличение уровня перфорина и гранзима В связаны с тяжестью клинических проявлений ЛГ [34].

Гранулизин. Гранулизин представляет собой цитолитический белок, выделяемый в основном CTL- и NK-клетками. Его функции заключаются в создании отверстий в клеточных мембранах и тем самым в уничтожении клеток-мишеней. В 2008 г. W.H. Chung et al. сообщили, что секреторный гранулизин 15 кДа служит ключевым посредником для диссеминированного апоптоза кератиноцитов, наблюдаемого при SJS/TEN [38]. В этом исследовании уровни гранулизина в блистерных жидкостях из кожных поражений пациентов с SJS/TEN были намного выше, чем уровни других цитотоксических белков, таких как перфорин, гранзим B и FasL, а при истощении гранулизина происходило уменьшение уровня цитотоксичности [38]. Дальнейшие исследования показали, что гранулизин в высокой степени экспрессирован у пациентов с ЛГ с клиническими проявлениями FDE, DRESS/DIHS и SJS/TEN, но не MPE [39–41].

ФНО-α, ИФН-γ, TARC, ИЛ-15 и другие цитокины/хемокины при SJS/TEN, DRESS/DIHS и AGEP. ФНО-α является основным провоспалительным цитокином и продуцируется макрофагами, Т-лимфоцитами, NK-клетками, нейтрофилами, тучными клетками и эозинофилами. Он регулирует иммунные ответы через индукцию клеточного апоптоза, активацию, дифференцировку и воспаление [42]. ФНО-α чрезвычайно экспрессирован и, как полагают, ответствен за обширный некроз кожных поражений у пациентов с SCAR [43, 44]. ИФН-γ критичен для врожденного и адаптивного иммунитета против вирусной и бактериальной инфекции и преимущественно продуцируется CD4+T хелперными клетками, CD8+CTL- и NK-клетками. По сообщениям, уровень ИФН-γ повышен в кожной ткани, блистерных клетках и плазме пациентов с мультиформной эритемой, SJS, TEN и DRESS/DIHS [34, 45, 46]. Иммунный механизм AGEP еще недостаточно изучен. Однако высокие уровни продукции ИЛ-8/CXCL8 и рекрутмента нейтрофилов отмечались при поражениях кожи у пациентов с AGEP [47–49]. Мутации в гене ИЛ-36RN, кодирующего антагонист рецептора ИЛ-36 (ИЛ-36Ra), также был идентифицирован у пациентов с AGEP [50, 51]. DRESS/DIHS характеризуется лейкоцитозом с атипичным лимфоцитозом или эозинофилией [52]. Регулирующий активацию хемокин тимуса TARC был идентифицирован в сыворотке как потенциальный биомаркер ранней стадии заболевания и предиктор активности болезни при DRESS/DIHS [53, 54]. По сравнению с пациентами MPE и SJS/TEN уровни TARC у пациентов с DRESS/DIHS были значительно выше во время острой фазы и коррелировали с кожными высыпаниями [54]. ИЛ-15 представляет собой цитокин, индуцирующий пролиферацию NK-клеток и других лейкоцитов, и, как было установлено, связан с тяжестью заболевания и смертностью при SJS/TEN [41]. Было также показано, что ИЛ-15 повышает цитотоксичность культивируемых NK-клеток и блистерных клеток пациентов с TEN [41]. Кроме того, было установлено, что и другие цитокины, а также хемокиновые рецепторы, включая ИЛ-2, -4, -5, -6, -8, -10, -12, -13, -18, CCR3, CXCR3, CXCR4 и CCR10, значительно повышены в кожных поражениях, блистерных жидкостях, РВМС или плазме пациентов с ЛГ и принимают участие в иммунной регуляции ЛГ [34, 41, 45, 46, 55–57].

Синдром-специфические эффекторные клетки. Синдромы SJS/TEN характеризуются глубоким некрозом, локализованным в эпидермисе. Цитотоксические CD8-Т-клетки, NK- и NK-Т- клетки, опосредующие патогенез болезни и продуцирующие цитотоксические молекулы, особенно гранулизин, вызывающий обширную гибель кератиноцитов, обильно представлены в образцах блистерной жидкости из поражений кожи пациентов с SJS/TEN. При этом уровни сывороточного гранулизина коррелируют с тяжестью острого заболевания и смертностью [38, 58]. Показано, что функция регуляторных Т-клеток (Tregs) при SJS/TEN неадекватна, хотя численность их и не изменена [59]. Иммунологические сдвиги при DRESS/DIHS характеризуются увеличением числа атипичных лимфоцитов или эозинофилов, при этом эозинофилия наблюдается еще на ранней стадии болезни [52, 60, 61]. Большинство пациентов с DRESS имели увеличенное число CD4+Т-клеток в острой стадии болезни, которое ассоциировалось с тяжестью таких клинических симптомов, как степень кожной сыпи и реактивации вируса [62]. Кроме того, Tregs играют важные роли в патогенезе DRESS/DIHS. Драматическая экспансия функциональных Tregs обнаружена в острой стадии DRESS/DIHS [59]. Предполагается, что CD4+FoxP3+Т-клетки служат ограничением тяжести острого заболевания путем регуляции ответов цитотоксических эффекторных Т-клеток. Тем не менее в конечном итоге ответы Treg истощаются и это может способствовать продолжению вирусной репликации и развитию преходящих рецидивов клинических симптомов [59, 63]. Что касается пациентов с AGEP, то у них повышенные нейтрофильные воспалительные процессы регулируются Т-лимфоцитами, что важно в патогенезе. Так, рекрутмент нейтрофилов наблюдался в кожных поражениях пациентов AGEP на поздней стадии развития болезни [47, 48].

Современные подходы к диагностике ЛГ

В современной литературе общепризнанно, что в алгоритме диагностики лекарственной аллергии на первом месте стоят методы общеклинической диагностики, особенно данные анамнеза (аллергологического, фармакологического, семейного), общеклинического обследования с выявлением основных синдромов, свойственных лекарственной аллергии [64–68]. Особое место уделяется тщательному сбору анамнеза, т.к. данные аллергологического и фармакологического анамнеза дают основание заподозрить развитие лекарственной аллергии или с большой долей вероятности отвергнуть ее наличие у пациента. И лишь в тех случаях, когда исключить диагноз ЛГ на основании анамнестических и клинических данных не представляется возможным, должна проводиться специфическая аллергологическая диагностика в специализированных центрах с использованием методов in vivo и in vitro.

Диагностика ЛГ немедленного типа

Для лабораторного подтверждения диагноза анафилаксии у пациента наиболее часто используется определение сывороточного уровня общей триптазы [69]. Во время эпизода анафилаксии могут быть осуществлены серийные измерения уровней триптазы, хотя следует отметить, что этот подход не так широко используется в клинической практике из-за ограничений, связанных с измерением триптазы во время острой фазы эпизода. Повышенные уровни гистамина, первого медиатора, высвобождаемого тучными клетками, в плазме или моче, также указывают на анафилаксию [2]. Однако вследствие того, что повышенный уровень гистамина плазмы носит кратковременный характер, оценка его пациентом через час и более после начала эпизода анафилаксии не дает ощутимой пользы [70]. В то же время следует помнить, что нормальные уровни триптазы или гистамина не исключают диагноза лекарственной гиперчувствительности [71]. Недавно ыыявленные новые биомаркеры, такие как ПАФ и карбоксипептидаза А3, использующиеся пока на экспериментальном уровне, дают надежду на то, что с их применением в клинических целях точность диагностики анафилаксии будет значительно повышена [71, 72].

При IgE-опосредованных реакциях гиперчувствительности для выявления причинно-значимого лекарственного средства часто применяют количественное определение сывороточного специфического IgE (sIgE) и тест активации базофила (BAT – basophil activation test).

Тесты, используемые для проведения иммуноанализа sIgE, включают радиоаллергосорбентное тестирование (RAST – radioallergosorbent testing), иммуноферментный анализ (ELISA – enzyme-linked immunosorbent assay) и флуороферментный иммуноанализ (FEIA – fluoroenzyme immunoassays) [73]. В то время как RAST или ELISA обычно проводятся с использованием штатного лабораторного оборудования, FEIA может выполняться с применением коммерческих продуктов, таких как тест-система ImmunoCAP-FEIA [74–76]. При этом следует отметить, что коммерческие наборы для определения специфических IgE существуют лишь для нескольких лекарственных средств, в т.ч и β-лактамных антибиотиков [75, 77]. Чувствительность используемых различных иммунологических тестов составляет в среднем 62,9%, тогда как средняя специфичность, позитивное предиктивное значение (PPV – positive predictive value) и негативное предиктивное значение (NPV – negative predictive value) – 89,2%, 83,3 и 77,8% соответственно [76]. Среднее NPV также является относительно низким, чтобы исключить аллергические реакции и определить, следует ли выполнять провокационный тест [78].

Тест BAT по сравнению с иммунологическими анализами обеспечивает более высокую среднюю специфичность (94,6%) и PPV (93,4%) [76]. Данный тест, основанный на проточно-цитометрическом определении активации базофилов или маркеров дегрануляции базофилов после стимулирования лекарственными препаратами, имитирует ситуацию контакта аллергена с клетками крови и позволяет зафиксировать изменения, провоцируемые аллергеном; при этом обычно измеряется также повышение уровня CD63 и CD203c [79].

Тесты на высвобождение медиаторов из активированных клеток оценивают выброс гистамина или лейкотриенов под действием лекарственного препарата. Однако эти методы имеют слишком низкие уровни чувствительности и специфичности, чтобы их можно было рекомендовать для целей диагностики [77, 80].

Диагностика ЛГ замедленного типа

Тесты in vitro. Определение биомаркеров ЛГ имеют решающее значение для клинических целей и может использоваться как в прогностических (как пациент будет отвечать на лечение), так и в диагностических целях (имеет ли пациент определенное заболевание). Ранее было показано, что гранулизин служит ключевой цитотоксической молекулой, ответственной за диссеминированный некроз кератиноцитов через действие цитотоксических лимфоцитов или NK-клеточно-опосредованной цитотоксичности без прямого клеточного контакта [38]. Была найдена значительная корреляция между уровнями гранулизина в блистерных жидкостях и клинической тяжестью [38]. Кроме того, уровни сывороточного гранулизина у пациентов с SJS/TEN были значительно повышены еще до отслоения кожи или поражений слизистой оболочки, а затем быстро снижались в течение 5 дней после начала болезни [39]. Поэтому в качестве потенциального маркера ранней фазы SJS/TEN был разработан простой, быстрый иммунохроматографический тест оценки повышенного сывороточного гранулизина для немедленного клинического применения. Длительное повышение уровня гранулизина в сыворотке также обнаружено у пациентов с DIHS, что указывает на возможность использования теста с гранулизином в целях ранней диагностики и прогнозирования данного фенотипа [81]. Кроме того, показана корреляция уровней ИЛ-15 с прогрессированием заболевания и смертностью пациентов с SJS/TEN на ранней стадии [41]. Уровни ИЛ-15 сыворотки могут быть дополнительно использованы в качестве маркера для ранней диагностики и мониторинга прогнозов [41]. По сообщениям, уровни TARC сыворотки у пациентов с DRESS/DIHS были значительно выше, чем у пациентов с SJS/TEN и MPE во время острой фазы и коррелировали с кожными высыпаниями [54]. Таким образом, TARC был идентифицирован как потенциальный биомаркер для раннего выявления и активности синдрома DRESS/DIHS, а также для определения прогноза системной тяжести воспаления при лекарственных высыпаниях, кроме SJS/TEN [53, 54]. Для AGEP на сегодняшний день не имеется идентифицированных специфических маркеров для диагностики или прогнозирования болезни [82].

Генетическое тестирование (определение HLA-аллелей) – единственный метод обследования, благодаря которому можно предвидеть и предупредить развитие лекарственной аллергии. Различные исследования показали строгую связь некоторых аллелей HLA с высоким риском развития тяжелых Т-клеточно-опосредованных реакций на такие препараты, как абакавир, карбамазепин и аллопуринол. Так, аллель HLAB*57:01 был связан с развитием DRESS/DIHS на препарат абакавир в большинстве этнических групп (чувствительность: 45,5–80%; специфичность: 97,6–99%) [83–85]. Кроме того, скрининг на HLA-B*57:01 снизил распространенность абакавир-опосредованных DHR с 7,8 в контроле до 3,4% у обследованных пациентов, демонстрируя, что это генетическое тестирование экономически эффективно во многих странах. Тем не менее следует отметить, что данный скрининг не предохраняет от развития других видов абакавир-опосредованных DHR [83, 86]. Аллель HLA-B*15:02 был сильно ассоциирован с развитием синдрома SJS/TEN на препарат карбамазепин в азиатских популяциях, по этой причине его скрининг рекомендован до начала лечения этим препаратом в группах риска [87–91]. Аллель HLA-B*58:01 связан с высоким риском аллопуринол-индуцированного DRESS и SJS/TEN у представителей азиатской и европейской популяций, и его скрининг рекомендован Американским колледжем ревматологии [92, 93]. Принимая во внимание эти данные, можно полагать, что имеется консенсус в отношении необходимости проведения генетического тестирования для конкретных лекарств, хотя их прогностические значения должны быть улучшены [86].

Несколько in vitro-тестов могут быть использованы для подтверждения причинно-значимого лекарственного средства, но точная чувствительность и специфичность таких тестов неизвестны [94, 95]. Так, в настоящее время доступны следующие тесты: тест трансформации лимфоцитов (LTT – lymphocyte transformation test), определение уровня экспрессии CD69, ELISpot (метод иммуноферментных пятен), внутриклеточное окрашивание цитокинов и иммуноферментный анализ (ELISA) для определения секреции цитотоксических медиаторов, включая воспалительные цитокины, хемокино-хемокиновые рецепторы, ИФН-γ, лиганд Fas-Fas, перфорин, гранзим B и гранулизин [96].

LTT является воспроизводимым тестом и основан на активации и пролиферации T-сенсибилизированных лимфоцитов под воздействием причинно-значимого препарата (β-лактамы и другие группы антибиотиков, НПВС, противосудорожные препараты). По различным данным, чувствительность теста зависит от причинно-значимого лекарственного препарата, клинических фенотипов и сроков проведения тестирования [97, 98]. LTT рекомендовано проводить не позже чем через 2–3 года после перенесенной реакции [99]. к недостаткам LTT относятся сложность и большие сроки исполнения (6–7 суток), необходимость иметь дорогостоящее оборудование, высококвалифицированный персонал и радиоактивные реактивы. Как и при других тестах in vitro, возможно получение как ложноположительных, так и ложноотрицательных результатов.

Определение уровня экспрессии CD69 служит более быстрой, простой и доступной альтернативой LTT. После активации Т-сенсибилизированных лимфоцитов причинно-значимым препаратом на поверхности лимфоцитов экспрессируются такие молекулы, как CD25, CD69, CD40L, и позднее – CD71, HLA-DR, которые можно определять методами проточной цитометрии или иммунофлуоресценции. В одном из исследований показана одинаковая информативность данного теста и LTT, но результаты тестирования с определением экспрессии CD69 были получены через 2, а LTT – через 6 дней [100, 101].

ELISPOT является одним из наиболее перспективных современных методов анализа продукции цитокинов изолированными клетками. Суть метода заключается в том, что выделенные клетки культивируют в присутствии индуктора синтеза цитокинов в микропланшетах, дно которых покрыто антителами к интересующему цитокину, как это делается на первом этапе ИФА. В процессе культивирования клетки, находящиеся на дне планшета, синтезируют цитокины, которые тут же связываются с сорбированными на пластике антителами. При этом цитокин соединяется с сорбированными антителами в тех местах, где его синтезировали клетки. Дальнейшие этапы анализа проводятся так же, как и в стандартном варианте ИФА, с той лишь разницей, что при постановке ELISPOT используется нерастворимый цветной субстрат ферментативной реакции, выпадающий в осадок там, где цитокин связался с сорбированными антителами. В результате на дне планшета образуются окрашенные пятна, соответствующие местам, где происходил синтез цитокинов клетками. Отсюда и произошло название метода ELISPOT как комбинация метода ELISA с конечным формированием окрашенного пятна (spot).

Метод внутриклеточного окрашивания цитокинов дает наиболее точную характеристику отдельных клеток, продуцирующих цитокины. Мембранные формы цитокинов и рецепторы цитокинов легко определяют на поверхности клеток с помощью меченных флюорохромами антител в обычном варианте цитофлуориметрии аналогично другим поверхностным молекулам клеток. Для выявления цитоплазматических цитокинов требуется достичь состояния проницаемости или пермебиализации мембран для обеспечения проникновения антител в клетки. Для этой цели используется сапонин в сочетании с блокаторами обратного транспорта (брефелдин А или монензин) для предотвращения экскреции антител из цитоплазмы клеток. Метод выгодно отличается от метода ELISPOT возможностью дополнительной характеристики клеток по размеру и экспрессии мембранных маркеров, что позволяет проводить более точную идентификацию цитокин-продуцирующих клеток.

Иммуноферментные методы в различных модификациях высокоспецифичны, быстры (время постановки ИФА не превышает 5 часов) и относительно просты в исполнении. Порог чувствительности для таких тест-систем достигает 0,5 пкг/мл. Актуальность использования LTT при тестировании SJS/TEN была относительно ниже, чем при тестировании DRESS/DIHS и AGEP [98]. Могут помочь увеличить чувствительность LTT или ELISPOT такие модификации, как ИФН-γ-ELISpot, или элиминация клеток Treg/CD25hi [102, 103]. ИФН-γ-ELISpot показал сходную чувствительность (67%) и специфичность при DRESS, но более высокую чувствительность (71%) при SJS/TEN [96]. Результаты теста на основе ELISA, используемого для определения гранулизина, показали лучшую чувствительность (86%) при SJS/TEN, но доказательства были ограничены из-за небольшого числа случаев в исследовании [104]. Таким образом, потребуются более крупные исследования для подтверждения как чувствительности, так и специфичности.

Тесты in vivo. К диагностическим тестам in vivo относятся провокационные тесты: кожные тесты (КТ), провокационный дозируемый тест (ПДТ). Данные тесты просты в исполнении, не требуют значительных материальных затрат. Однако следует помнить, что при проведении этих тестов могут развиваться тяжелые системные реакции.

Кожные тесты включают аппликационные тесты (patch tests), укол (прик-тест) и внутрикожные тесты. Аппликационные тесты, как правило, безопасны и не обладают в отличие от внутрикожных тестов раздражающим действием [105]. Ценность патч-тестирования зависит от фенотипов и вовлеченных лекарственных средств. Чувствительность такого тестирования обычно составляет <70%, но более высокая чувствительность была показана при AGEP и некоторых других фенотипах, таких как абакавир-гиперчувствительность и индуцированный карбамазепином синдром SJS/DRESS, а также у пациентов с фиксированной лекарственной сыпью [95, 105, 106]. Другие кожные тесты (прик-тест или внутрикожное тестирование) рассматриваются в качестве ключевых инструментов для оценки реакций лекарственной гиперчувствительности, включая IgE-опосредованную гиперчувствительность или гиперчувствительность замедленного типа [107–109]. Тем не менее эти кожные тесты обычно не предлагаются для пациентов SCAR из-за риска рецидива, несмотря на то что внутрикожные тесты имеют значение для пациентов AGEP, а отрицательные аппликационные пробы представляют ценность для пациентов SCAR [105, 110].

Провокационный дозируемый тест считается «золотым» стандартом для подтверждения потенциальной специфичности лекарственного средства при ЛГ, однако его использование пациентами SCAR не практикуется из-за возможных жизнеугрожающих последствий.

Заключение

Реакции ЛГ проявляются преимущественно в виде реакций либо немедленного типа (развиваются в течение нескольких минут или часов после воздействия препарата в разной клинической форме – от легких проявлений в виде зуда и крапивницы до угрожающих жизни симптомов анафилаксии), либо замедленного типа (характеризуются замедленным началом развития клинических проявлений – через несколько дней или даже недель после воздействия препарата с варьированием симптомов в диапазоне от мягких макулопапулезных экзантем до угрожающей жизни SCAR). Диагностика ЛГ представляет необычайную сложность и традиционно основана на анамнезе заболевания, данных общеклинического обследования пациента и положительных кожных тестах. В то же время кожные тесты часто могут давать ложно-позитивные результаты, а использование их пациентами SCAR и с эпизодами угрожающей жизни анафилаксии в анамнезе противопоказано. «Золотым» стандартом для выявления лекарства, вызвавшего развитие гиперчувствительных реакций, служат лекарственные провокационные тесты, но и они из-за высоких рисков развития системных реакций используются не очень широко. Поэтому важным подспорьем для диагностики ЛГ в наши дни являются тесты in vitro, безопасные для больного и высокоинформативны. Однако и они лишь дополняют анамнез, к тому же перечень коммерческих наборов для диагностики ЛГ весьма ограничен. И тем не менее, несмотря на эти сложности диагностики, прогресс в изучении ЛГ очевиден и связан с успехами в области иммунологической генетики, позволившие выдвинуть новые концепции молекулярных механизмов развития ЛГ, такие как концепция фармакологического взаимодействия, модель измененного пептидного репертуара и модель измененного репертуара TCR. Эти новые концепции в свою очередь не только дополнили существующую на сегодня гаптенную теорию, но и значительно расширили видение такой проблемы, как лекарственная гиперчувствительность, что имеет неоценимую клиническую значимость и представляет несомненную практическую пользу для врачей. Кроме того, современными фармакогеномными исследованиями показана строгая связь некоторых аллелей HLA c высоким риском развития тяжелых реакций лекарственной аллергии на определенные препараты, что позволило разработать тест-системы для выявления предрасположенных лиц и предупреждения развития у них реакций ЛГ. Есть надежда, что дальнейшие исследования в области молекулярных механизмов развития ЛГ будут еще более результативными и откроют новые возможности для диагностики этого чрезвычайно опасного для здоровья патологического состояния.