Введение

Системная красная волчанка (СКВ) – аутоиммунное заболевание, характеризующееся нарушением регуляции иммунной системы, что ведет к гиперактивации Т- и В-лимфоцитов. Известно, что данные изменения приводят к повышению продукции аутоантител и образованию иммунных комплексов (ИК), обладающих повреждающим действием в результате отложения в различных органах и тканях [4]. Клинические проявления СКВ разнообразны, поэтому большое значение имеет поиск потенциальных биомаркеров, как отражающих риск вовлечения в патологический процесс различных органов, так и являющихся чувствительными индикаторами активности заболевания [7].

Поражение почек при СКВ является одним из наиболее серьезных висцеритов, зачастую определяющим тяжесть заболевания и раннюю инвалидизацию больных. Даже при использовании современных иммуносупрессивных препаратов 20-летняя выживаемость не превышает 20 %. Клинические проявления волчаночной нефропатии встречаются в 50–70 % всех случаев СКВ, тогда как морфологические признаки нефропатии обнаруживаются у 100 % больных.

За последнее десятилетие возрос интерес нефрологов к изучению биологических маркеров воспаления и повреждения почек: цитокинов, острофазных белков, факторов ангио- и фиброгенеза, играющих важную роль в формировании нефросклероза. Наибольшую диагностическую значимость имеют результаты неинвазивного метода определения данных маркеров в моче [2]. В современной нефрологии наиболее востребованы методы лабораторной диагностики воспалительных и склеротических изменений паренхимы почек, основанные на анализе концентрации биомаркеров. Результаты этих исследований могут использоваться для выявления ранних стадий хронической болезни почек (ХБП), а также своевременного проведения адекватной терапии.

В настоящее время цитокины, острофазные белки, факторы ангио- и фиброгенеза у пациентов с СКВ мало изучены. Наряду с имеющимися в литературе данными о повышении уровней интерлейкинов (ИЛ) в сыворотке крови пациентов с СКВ, таких как интерлейкин-1β (ИЛ-1β) [3, 5], интерлейкин-6 (ИЛ-6) [8, 9], фактора некроза опухоли-α (ФНО-α) [1, 6, 8, 10], и об их связи с активностью процесса имеются сообщения об отсутствии значимого повышения указанных цитокинов в сыворотке крови этих больных, взаимосвязей с клиническими проявлениями. Следует отметить, что в литературе нами не обнаружено исследований, посвященных определению содержания цитокинов в крови и моче пациентов с СКВ, не исследовались их связи с активностью и клиническими проявлениями патологического процесса.

Целью настоящей работы стало изучение изменений уровней ряда маркеров в сыворотке крови и моче больных СКВ, определение взаимосвязей между уровнями исследуемых маркеров и активностью заболевания, характером течения, клиническими проявлениями СКВ.

Материал и методы

Исследованы 40 пациентов с достоверным диагнозом СКВ, находившихся на обследовании и лечении в ГУЗ «Областная клиническая больница» (Саратов) в период с января по май 2013 г. Диагноз установлен при наличии четырех и более критериев, согласно данным Американской ревматологической ассоциации (АРА, 1982). Группа исследуемых больных состояла из 39 женщин и 1 мужчины. Средний возраст пациентов составил 42,15 ± 14,44 года, возраст дебюта заболевания – 31,5 ± 15,51, длительность заболевания – 11,2 ± 10,0 лет. Большинство пациентов имели хроническое течение – 24 (60 %) больных, подострое выявлено у 9 (22,5 %), острое – у 7 (17,5 %) пациентов. I степень активности заболевания диагностирована у 25 (62,5 %) пациентов, II – у 14 (35 %) и III – у 1 (2,5 %) больного.

Кожные изменения (эритема по типу «бабочки», другие виды эритемы, дискоидные высыпания) зафиксированы в 19 (47,5 %) случаях; аллопеция – в 10 (2,5 %), хейлит – в 6 (15 %), стоматит – в 7 (17,5 %); серозиты (плевриты, перикардиты) выявлены у 13 (32,5 %) больных; артрит – у 28 (70 %), синдром Рейно – 9 (22,5 %) пациентов, антифосфолипидный синдром (АФС) установлен в 10 (25 %) случаях, поражение почек в виде гломерулонефрита – в 16 (40 %), гепатоспленомегалия – в 9 (22,5 %); поражение сердца в виде миокардита выявлено у 4 (10 %) пациентов, эндокардита – у 1 (2,5 %).

Для сравнительной оценки маркеров воспаления и повреждения почек в сыворотке крови и моче была обследована группа 20 практически здоровых доноров, не имевших патологии сердечно-сосудистой и мочевыделительной систем, сопоставимых по полу, возрасту, индексу массы тела, уровню артериального давления с исследуемой группой больных СКВ (p > 0,05).

Проведен сбор анамнестических данных, объективное обследование пациентов, выполнен комплекс общепринятых лабораторных исследований. Для количественного анализа биомаркеров взятие крови у пациентов исследуемой группы и пациентов группы сравнения осуществлено натощак в утренние часы, из кубитальной вены с использованием систем для забора крови Vacuette с активатором свертывания крови и разделительным гелем. Первую порцию утренней мочи в объеме не менее 100 мл собрали в специальные стаканы с крышками. Предварительно в емкость для забора мочи внесли 20 мкл раствора ProClin 300 (SUPELCO, США). Аликвоты сыворотки крови и мочи разлили в пробирки с крышками типа Eppendorf объемом 2 мл и хранили до проведения исследования при температуре -25 ºС.

Концентрацию интерлейкинов (ИЛ-1β, -6, -8, -10), фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-α), маркера активности воспалительного процесса моноцитарного хемоаттрактанта-1 (МСР-1), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF – Vascular endothelial growth factor) в сыворотке крови и моче обследуемых определены методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием соответствующих наборов реагентов ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск). Исследование этих биомаркеров на больных СКВ проведено однократно. Для оценки функционального состояния почек у всех пациентов определен креатинин сыворотки крови по методу Яффе на биохимическом анализаторе Hitachi-912 с использованием реагентов фирмы «DiaSys», исследовался общий анализ мочи, у части больных изучалась суточная протеинурия, выполнена проба Нечипоренко, УЗИ почек. Оценивались особенности патологии сердечно-сосудистой и мочевыделительной систем.

Статистическая обработка осуществлена с использованием программ Microsoft Office Exсel 2007 (Microsoft Corp., США) и Statistica 8.0 (StatSoft Inc., США). Характер распределения данных оценен графическим методом с использованием критерия Шапиро–Уилка. Описание признаков, имеющих нормальное распределение, представлено в виде M ± SD, где М – среднее арифметическое, SD – стандартное отклонение; для признаков с распределением, отличным от нормального, результаты представлены в виде Ме [Q1; Q3], где Me – медиана, Q1 и Q3 – первый и третий квартили. Для обработки данных с распределением, отличным от нормального, применены непараметрические методы: критерий Манна–Уитни, критерий χ2 с поправкой Йетса. Для оценки взаимосвязи между отдельными показателями использован корреляционный анализ с расчетом непараметрического коэффициента корреляции Спирмена. При сравнении более чем двух независимых группировок применены методы дисперсионного анализа: параметрический дисперсионный анализ для нормально распределенных данных и ранговый анализ вариаций по Краскелу–Уоллису для данных с распределением, отличным от нормального. Различия между показателями считали значимыми при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

Нами установлено статистически значимое повышение концентрации VEGF (р = 0,001), МСР-1 (р = 0,001), ИЛ-6 (р = 0,01) в сыворотке крови больных СКВ по сравнению с лицами группы сравнения. Содержание ИЛ-8 в сыворотке крови пациентов с СКВ имело тенденцию к повышению по сравнению с лицами группы сравнения, однако значимых различий не достигло (р > 0,05). Концентрации ИЛ-1β, -10 и ФНО-α в сыворотке крови лиц группы сравнения оказались значимо выше, нежели у больных СКВ; результаты представлены в табл. 1 и 2.

В моче пациентов с СКВ установлено существенное повышение уровня VEGF (р = 0,001), ИЛ-6 (р = 0,001) и ИЛ-8 (р = 0,01) по сравнению с лицами группы сравнения. Концентрация МСР-1 в моче больных СКВ имела тенденцию к повышению, однако значимых различий с лицами группы сравнения не достигла (р > 0,05). Концентрации ИЛ-1β, -10 и ФНО-α в моче пациентов с СКВ оказались значимо ниже, нежели в пробах мочи лиц группы сравнения.

Изучены уровни биомаркеров в сыворотке крови и моче больных различным течением СКВ; результаты представлены в табл. 3.

При сравнении концентрации биомаркеров в сыворотке крови пациентов с различным течением СКВ выявлены статистически значимые различия в содержании VEGF, MCP-1, ИЛ-6, -8 по сравнению с уровнем биомаркеров у лиц группы сравнения (р < 0,05). В моче обнаружены статистически значимые различия в концентрации VEGF, ИЛ-6, -8 у пациентов с острым, подострым и хроническим течением СКВ по сравнению с аналогичными маркерами у лиц группы сравнения (р < 0,05). Установлено существенное повышение концентрации МСР-1 в моче пациентов с подострым течением заболевания (р < 0,05).

Исследованы концентрации биомаркеров в сыворотке крови и пробах мочи пациентов с первой и второй степенями активности СКВ (табл. 4).

В исследуемых пробах крови пациентов с I степенью активности СКВ по сравнению с лицами группы сравнения обнаружено значимое повышение уровней концентрации VEGF, MCP-1, ИЛ-6, -8 (p < 0,05); в пробах мочи отмечено значимое увеличение концентрации этих хемокинов, за исключением МСР-1 (р > 0,05). У пациентов со II степенью активности в пробах сыворотки крови и мочи существенно повышены концентрации VEGF и ИЛ-8 (p < 0,05) относительно лиц группы сравнения. При этом уровень ИЛ-6 значимо увеличился только лишь в пробах мочи (p < 0,05). Концентрация МСР-1 у пациентов со II степенью активности по сравнению с ее концентрацией у лиц группы сравнения существенно не изменялась ни в пробах крови, ни в пробах мочи (р > 0,05). При сравнении показателей концентрации данных биомаркеров в сыворотке крови и моче между пациентами с первой и второй степенями активности достоверных различий не выявлено (р > 0,05). Сравнительного анализа концентрации биомаркеров у пациентов с III степенью активности нами не проведено ввиду малой численности пациентов данной группы.

Сделан анализ изменений изучаемых биомаркеров сыворотки крови и мочи у больных СКВ в зависимости от проявлений самого заболевания. Достоверное увеличение концентрации VEGF сыворотки крови выявлено при наличии у пациентов стоматита по сравнению с пациентами СКВ, у которых стоматит отсутствовал (422,2 [308,2;874,6] и 210,8 [119,3;347,1] соответственно, р = 0,04). При проведении рангового анализа между группами пациентов СКВ с различными гематологическими нарушениями, такими как анемия, тромбоцитопения, лейкопения, нами выявлено значимое изменение концентрации VEGF сыворотки крови (n = 40; h = 9,6; p = 0,0355). VEGF, исследуемый в пробах мочи, значимо выше у пациентов с патологией почек (гломерулонефрит и др.) по сравнению с больными СКВ, у которых патологии почек выявлено не было (292,75 [148,9;446,10] и 182,5 [118,4;245,3] соответственно, р = 0,033), однако при мониторинге изучаемого показателя в зависимости от варианта проявления поражения почек существенных изменений нами не выявлено (p > 0,05). Концентрация МСР-1 сыворотки крови значимо увеличилась у пациентов с СКВ при наличии LE-клеток по сравнению с больными, не имевшими в крови данных клеток (876,9 [463,1;1716] и 302,4 [134,2;573,8] соответственно, р = 0,0067). Мониторинг концентрации интерлейкинов сыворотки крови и мочи не показал существенных изменений в зависимости от проявлений заболевания.

При проведении корреляционного анализа установлены взаимосвязи между концентрацией ФНО-α и количеством АТ к ДНК (r = 0,414, р = 0,021); ИЛ-10 и уровнем СРБ (r = 0,359, р = 0,023), ИЛ-10 и СКФ (r = -0,322; p = 0,042); ИЛ-6 сыворотки крови и длительностью заболевания (r = 0,350; р = 0,027).

Обсуждение. VEGF является одним из полипептидных белков, участвующих в воспалении и регуляции иммунного ответа, особенно при ревматических заболеваниях. В нашем исследовании данный биомаркер убедительно доказал свое участие в поддержании системного воспалительного процесса и вовлечения в него тубулоинтерстициальной ткани почек обследуемых пациентов, на что указывает его существенное повышение как в сыворотке крови, так и в пробах мочи больных СКВ с поражением почек.

Нами не выявлено статистически значимых различий концентраций исследуемых биомаркеров у больных при различном течении заболевания и разной активности воспалительного процесса. Возможно, это связано с высокой степенью идентичности биологических эффектов многих цитокинов, особенно интерлейкинов, создающей широкие возможности для компенсации недостаточности дефицита многих медиаторов другими, кроме того, многие цитокины способны взаимодействовать со структурами одних и тех же рецепторных комплексов. Именно это обстоятельство объясняет отсутствие корреляции между содержанием тех или иных цитокинов и клиническими особенностями течения заболевания.

Одновременное нарастание в моче и сыворотке крови содержания МСР-1 и VEGF свидетельствует об активации воспалительного процесса у больных СКВ на уровне не только эпителия мочевыводящих путей, но и экстрацеллюлярного матрикса почечной паренхимы, т.е. о развитии процессов тубулоинтерстициального фиброза и эндотелиальной дисфункции. В настоящее время многими исследователями придается большое значение трансдифференцировке трубчатых эпителиальных клеток при участии инфильтратов в миофибробласты, которые могут активно размножаться и синтезировать вещества внеклеточного матрикса, что приводит к последующей потери функции почек. Поскольку моноциты/макрофаги являются основным компонентом инфильтратов почечного интерстиция, можно считать, что нарастание в моче содержания МСР-1 у больных СКВ характеризует тяжесть тубулоинтерстициального повреждения, а подъем уровня VEGF – формирование эндотелиальной дисфункции с последующей деструкцией органной архитектуры.

Уровень ИЛ-6 повышен как в сыворотке крови, так и в моче пациентов с СКВ. В нашем исследовании установлена взаимосвязь ИЛ-6 с длительностью заболевания. Отсутствие повышения уровней ИЛ-1β, -10 и ФНО-α в сыворотке крови и пробах мочи пациентов с СКВ, по-видимому, может быть обусловлено проведением активной иммуносупрессивной терапии, а также длительным течением хронического воспалительного процесса.

В целом выполненное исследование продемонстрировало сходство и различия исследуемых биомаркеров в сыворотке крови и моче пациентов с СКВ, а также важную патогенетическую роль этих цитокинов в развитии данного заболевания.