Diagnostic significance of biomarkers detection in blood and urine of patients with systemic lupus erythematosus


A.P. Rebrov, N.B. Zakharova, A.N. Oksen'chuk, O.G. Karpova, D.A. Patrikeeva, E.B. Popikhalova

SBEU HPE Saratov State Medical University n.a. V.I. Razumovsky of Ministry of Healthcare of Russian Federation
Aim. Study of change of dynamics of levels of biomarkers in blood seruma and urine in patients with systemic lupus erythematosus (SLE).
Methods. 40 patients with SLE were included into the study. Levels of interleukins, tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), monocyte chemotaxic protein type 1 (МСР-1), vessel-endothelial growth factor (VEGF) in blood serum and urine were determined by immunoenzyme analysis.
Results. Levels of VEGF, МСР-1, interleukin-6 (IL-6) were elevated in blood serum; levels of VEGF, IL-6 and IL-8 – in the urine. Biomarkers blood and urine levels did not differed significantly according to SLE activity.
Conclusion. Biomarkers determination in blood and urine can help monitoring of clinical evolution and activity of systemic lupus erythematosus.

Введение

Системная красная волчанка (СКВ) – аутоиммунное заболевание, характеризующееся нарушением регуляции иммунной системы, что ведет к гиперактивации Т- и В-лимфоцитов. Известно, что данные изменения приводят к повышению продукции аутоантител и образованию иммунных комплексов (ИК), обладающих повреждающим действием в результате отложения в различных органах и тканях [4]. Клинические проявления СКВ разнообразны, поэтому большое значение имеет поиск потенциальных биомаркеров, как отражающих риск вовлечения в патологический процесс различных органов, так и являющихся чувствительными индикаторами активности заболевания [7].

Поражение почек при СКВ является одним из наиболее серьезных висцеритов, зачастую определяющим тяжесть заболевания и раннюю инвалидизацию больных. Даже при использовании современных иммуносупрессивных препаратов 20-летняя выживаемость не превышает 20 %. Клинические проявления волчаночной нефропатии встречаются в 50–70 % всех случаев СКВ, тогда как морфологические признаки нефропатии обнаруживаются у 100 % больных.

За последнее десятилетие возрос интерес нефрологов к изучению биологических маркеров воспаления и повреждения почек: цитокинов, острофазных белков, факторов ангио- и фиброгенеза, играющих важную роль в формировании нефросклероза. Наибольшую диагностическую значимость имеют результаты неинвазивного метода определения данных маркеров в моче [2]. В современной нефрологии наиболее востребованы методы лабораторной диагностики воспалительных и склеротических изменений паренхимы почек, основанные на анализе концентрации биомаркеров. Результаты этих исследований могут использоваться для выявления ранних стадий хронической болезни почек (ХБП), а также своевременного проведения адекватной терапии.

В настоящее время цитокины, острофазные белки, факторы ангио- и фиброгенеза у пациентов с СКВ мало изучены. Наряду с имеющимися в литературе данными о повышении уровней интерлейкинов (ИЛ) в сыворотке крови пациентов с СКВ, таких как интерлейкин-1β (ИЛ-1β) [3, 5], интерлейкин-6 (ИЛ-6) [8, 9], фактора некроза опухоли-α (ФНО-α) [1, 6, 8, 10], и об их связи с активностью процесса имеются сообщения об отсутствии значимого повышения указанных цитокинов в сыворотке крови этих больных, взаимосвязей с клиническими проявлениями. Следует отметить, что в литературе нами не обнаружено исследований, посвященных определению содержания цитокинов в крови и моче пациентов с СКВ, не исследовались их связи с активностью и клиническими проявлениями патологического процесса.

Целью настоящей работы стало изучение изменений уровней ряда маркеров в сыворотке крови и моче больных СКВ, определение взаимосвязей между уровнями исследуемых маркеров и активностью заболевания, характером течения, клиническими проявлениями СКВ.

Материал и методы

Исследованы 40 пациентов с достоверным диагнозом СКВ, находившихся на обследовании и лечении в ГУЗ «Областная клиническая больница» (Саратов) в период с января по май 2013 г. Диагноз установлен при наличии четырех и более критериев, согласно данным Американской ревматологической ассоциации (АРА, 1982). Группа исследуемых больных состояла из 39 женщин и 1 мужчины. Средний возраст пациентов составил 42,15 ± 14,44 года, возраст дебюта заболевания – 31,5 ± 15,51, длительность заболевания – 11,2 ± 10,0 лет. Большинство пациентов имели хроническое течение – 24 (60 %) больных, подострое выявлено у 9 (22,5 %), острое – у 7 (17,5 %) пациентов. I степень активности заболевания диагностирована у 25 (62,5 %) пациентов, II – у 14 (35 %) и III – у 1 (2,5 %) больного.

Кожные изменения (эритема по типу «бабочки», другие виды эритемы, дискоидные высыпания) зафиксированы в 19 (47,5 %) случаях; аллопеция – в 10 (2,5 %), хейлит – в 6 (15 %), стоматит – в 7 (17,5 %); серозиты (плевриты, перикардиты) выявлены у 13 (32,5 %) больных; артрит – у 28 (70 %), синдром Рейно – 9 (22,5 %) пациентов, антифосфолипидный синдром (АФС) установлен в 10 (25 %) случаях, поражение почек в виде гломерулонефрита – в 16 (40 %), гепатоспленомегалия – в 9 (22,5 %); поражение сердца в виде миокардита выявлено у 4 (10 %) пациентов, эндокардита – у 1 (2,5 %).

Для сравнительной оценки маркеров воспаления и повреждения почек в сыворотке крови и моче была обследована группа 20 практически здоровых доноров, не имевших патологии сердечно-сосудистой и мочевыделительной систем, сопоставимых по полу, возрасту, индексу массы тела, уровню артериального давления с исследуемой группой больных СКВ (p > 0,05).

Проведен сбор анамнестических данных, объективное обследование пациентов, выполнен комплекс общепринятых лабораторных исследований. Для количественного анализа биомаркеров взятие крови у пациентов исследуемой группы и пациентов группы сравнения осуществлено натощак в утренние часы, из кубитальной вены с использованием систем для забора крови Vacuette с активатором свертывания крови и разделительным гелем. Первую порцию утренней мочи в объеме не менее 100 мл собрали в специальные стаканы с крышками. Предварительно в емкость для забора мочи внесли 20 мкл раствора ProClin 300 (SUPELCO, США). Аликвоты сыворотки крови и мочи разлили в пробирки с крышками типа Eppendorf объемом 2 мл и хранили до проведения исследования при температуре -25 ºС.

Концентрацию интерлейкинов (ИЛ-1β, -6, -8, -10), фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-α), маркера активности воспалительного процесса моноцитарного хемоаттрактанта-1 (МСР-1), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF – Vascular endothelial growth factor) в сыворотке крови и моче обследуемых определены методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием соответствующих наборов реагентов ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск). Исследование этих биомаркеров на больных СКВ проведено однократно. Для оценки функционального состояния почек у всех пациентов определен креатинин сыворотки крови по методу Яффе на биохимическом анализаторе Hitachi-912 с использованием реагентов фирмы «DiaSys», исследовался общий анализ мочи, у части больных изучалась суточная протеинурия, выполнена проба Нечипоренко, УЗИ почек. Оценивались особенности патологии сердечно-сосудистой и мочевыделительной систем.

Статистическая обработка осуществлена с использованием программ Microsoft Office Exсel 2007 (Microsoft Corp., США) и Statistica 8.0 (StatSoft Inc., США). Характер распределения данных оценен графическим методом с использованием критерия Шапиро–Уилка. Описание признаков, имеющих нормальное распределение, представлено в виде M ± SD, где М – среднее арифметическое, SD – стандартное отклонение; для признаков с распределением, отличным от нормального, результаты представлены в виде Ме [Q1; Q3], где Me – медиана, Q1 и Q3 – первый и третий квартили. Для обработки данных с распределением, отличным от нормального, применены непараметрические методы: критерий Манна–Уитни, критерий χ2 с поправкой Йетса. Для оценки взаимосвязи между отдельными показателями использован корреляционный анализ с расчетом непараметрического коэффициента корреляции Спирмена. При сравнении более чем двух независимых группировок применены методы дисперсионного анализа: параметрический дисперсионный анализ для нормально распределенных данных и ранговый анализ вариаций по Краскелу–Уоллису для данных с распределением, отличным от нормального. Различия между показателями считали значимыми при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

Нами установлено статистически значимое повышение концентрации VEGF (р = 0,001), МСР-1 (р = 0,001), ИЛ-6 (р = 0,01) в сыворотке крови больных СКВ по сравнению с лицами группы сравнения. Содержание ИЛ-8 в сыворотке крови пациентов с СКВ имело тенденцию к повышению по сравнению с лицами группы сравнения, однако значимых различий не достигло (р > 0,05). Концентрации ИЛ-1β, -10 и ФНО-α в сыворотке крови лиц группы сравнения оказались значимо выше, нежели у больных СКВ; результаты представлены в табл. 1 и 2.

В моче пациентов с СКВ установлено существенное повышение уровня VEGF (р = 0,001), ИЛ-6 (р = 0,001) и ИЛ-8 (р = 0,01) по сравнению с лицами группы сравнения. Концентрация МСР-1 в моче больных СКВ имела тенденцию к повышению, однако значимых различий с лицами группы сравнения не достигла (р > 0,05). Концентрации ИЛ-1β, -10 и ФНО-α в моче пациентов с СКВ оказались значимо ниже, нежели в пробах мочи лиц группы сравнения.

Изучены уровни биомаркеров в сыворотке крови и моче больных различным течением СКВ; результаты представлены в табл. 3.

При сравнении концентрации биомаркеров в сыворотке крови пациентов с различным течением СКВ выявлены статистически значимые различия в содержании VEGF, MCP-1, ИЛ-6, -8 по сравнению с уровнем биомаркеров у лиц группы сравнения (р < 0,05). В моче обнаружены статистически значимые различия в концентрации VEGF, ИЛ-6, -8 у пациентов с острым, подострым и хроническим течением СКВ по сравнению с аналогичными маркерами у лиц группы сравнения (р < 0,05). Установлено существенное повышение концентрации МСР-1 в моче пациентов с подострым течением заболевания (р < 0,05).

Исследованы концентрации биомаркеров в сыворотке крови и пробах мочи пациентов с первой и второй степенями активности СКВ (табл. 4).

В исследуемых пробах крови пациентов с I степенью активности СКВ по сравнению с лицами группы сравнения обнаружено значимое повышение уровней концентрации VEGF, MCP-1, ИЛ-6, -8 (p < 0,05); в пробах мочи отмечено значимое увеличение концентрации этих хемокинов, за исключением МСР-1 (р > 0,05). У пациентов со II степенью активности в пробах сыворотки крови и мочи существенно повышены концентрации VEGF и ИЛ-8 (p < 0,05) относительно лиц группы сравнения. При этом уровень ИЛ-6 значимо увеличился только лишь в пробах мочи (p < 0,05). Концентрация МСР-1 у пациентов со II степенью активности по сравнению с ее концентрацией у лиц группы сравнения существенно не изменялась ни в пробах крови, ни в пробах мочи (р > 0,05). При сравнении показателей концентрации данных биомаркеров в сыворотке крови и моче между пациентами с первой и второй степенями активности достоверных различий не выявлено (р > 0,05). Сравнительного анализа концентрации биомаркеров у пациентов с III степенью активности нами не проведено ввиду малой численности пациентов данной группы.

Сделан анализ изменений изучаемых биомаркеров сыворотки крови и мочи у больных СКВ в зависимости от проявлений самого заболевания. Достоверное увеличение концентрации VEGF сыворотки крови выявлено при наличии у пациентов стоматита по сравнению с пациентами СКВ, у которых стоматит отсутствовал (422,2 [308,2;874,6] и 210,8 [119,3;347,1] соответственно, р = 0,04). При проведении рангового анализа между группами пациентов СКВ с различными гематологическими нарушениями, такими как анемия, тромбоцитопения, лейкопения, нами выявлено значимое изменение концентрации VEGF сыворотки крови (n = 40; h = 9,6; p = 0,0355). VEGF, исследуемый в пробах мочи, значимо выше у пациентов с патологией почек (гломерулонефрит и др.) по сравнению с больными СКВ, у которых патологии почек выявлено не было (292,75 [148,9;446,10] и 182,5 [118,4;245,3] соответственно, р = 0,033), однако при мониторинге изучаемого показателя в зависимости от варианта проявления поражения почек существенных изменений нами не выявлено (p > 0,05). Концентрация МСР-1 сыворотки крови значимо увеличилась у пациентов с СКВ при наличии LE-клеток по сравнению с больными, не имевшими в крови данных клеток (876,9 [463,1;1716] и 302,4 [134,2;573,8] соответственно, р = 0,0067). Мониторинг концентрации интерлейкинов сыворотки крови и мочи не показал существенных изменений в зависимости от проявлений заболевания.

При проведении корреляционного анализа установлены взаимосвязи между концентрацией ФНО-α и количеством АТ к ДНК (r = 0,414, р = 0,021); ИЛ-10 и уровнем СРБ (r = 0,359, р = 0,023), ИЛ-10 и СКФ (r = -0,322; p = 0,042); ИЛ-6 сыворотки крови и длительностью заболевания (r = 0,350; р = 0,027).

Обсуждение. VEGF является одним из полипептидных белков, участвующих в воспалении и регуляции иммунного ответа, особенно при ревматических заболеваниях. В нашем исследовании данный биомаркер убедительно доказал свое участие в поддержании системного воспалительного процесса и вовлечения в него тубулоинтерстициальной ткани почек обследуемых пациентов, на что указывает его существенное повышение как в сыворотке крови, так и в пробах мочи больных СКВ с поражением почек.

Нами не выявлено статистически значимых различий концентраций исследуемых биомаркеров у больных при различном течении заболевания и разной активности воспалительного процесса. Возможно, это связано с высокой степенью идентичности биологических эффектов многих цитокинов, особенно интерлейкинов, создающей широкие возможности для компенсации недостаточности дефицита многих медиаторов другими, кроме того, многие цитокины способны взаимодействовать со структурами одних и тех же рецепторных комплексов. Именно это обстоятельство объясняет отсутствие корреляции между содержанием тех или иных цитокинов и клиническими особенностями течения заболевания.

Одновременное нарастание в моче и сыворотке крови содержания МСР-1 и VEGF свидетельствует об активации воспалительного процесса у больных СКВ на уровне не только эпителия мочевыводящих путей, но и экстрацеллюлярного матрикса почечной паренхимы, т.е. о развитии процессов тубулоинтерстициального фиброза и эндотелиальной дисфункции. В настоящее время многими исследователями придается большое значение трансдифференцировке трубчатых эпителиальных клеток при участии инфильтратов в миофибробласты, которые могут активно размножаться и синтезировать вещества внеклеточного матрикса, что приводит к последующей потери функции почек. Поскольку моноциты/макрофаги являются основным компонентом инфильтратов почечного интерстиция, можно считать, что нарастание в моче содержания МСР-1 у больных СКВ характеризует тяжесть тубулоинтерстициального повреждения, а подъем уровня VEGF – формирование эндотелиальной дисфункции с последующей деструкцией органной архитектуры.

Уровень ИЛ-6 повышен как в сыворотке крови, так и в моче пациентов с СКВ. В нашем исследовании установлена взаимосвязь ИЛ-6 с длительностью заболевания. Отсутствие повышения уровней ИЛ-1β, -10 и ФНО-α в сыворотке крови и пробах мочи пациентов с СКВ, по-видимому, может быть обусловлено проведением активной иммуносупрессивной терапии, а также длительным течением хронического воспалительного процесса.

В целом выполненное исследование продемонстрировало сходство и различия исследуемых биомаркеров в сыворотке крови и моче пациентов с СКВ, а также важную патогенетическую роль этих цитокинов в развитии данного заболевания.


About the Autors


Rebrov A.P., MD, PhD, professor, head of hospital therapy chair of medical faculty SBEU HPE Saratov State Medical University n.a. V.I. Razumovsky of Ministry of Healthcare of Russian Federation
E-mail: andreyrebrov@yandex.ru
Zakharova N.B., MD, PhD, professor, head of Central Research Laboratory of SBEU HPE Saratov State Medical University n.a. V.I. Razumovsky of Ministry of Healthcare of Russian Federation
Oksen'chuk A.N., assistant professor of hospital therapy chair of medical faculty SBEU HPE Saratov State Medical University n.a. V.I. Razumovsky of Ministry of Healthcare of Russian Federation
Karpova O.G., assistant professor of hospital therapy chair of medical faculty SBEU HPE Saratov State Medical University n.a. V.I. Razumovsky of Ministry of Healthcare of Russian Federation
Patrikeeva D.A., assistant professor of hospital therapy chair of medical faculty SBEU HPE Saratov State Medical University n.a. V.I. Razumovsky of Ministry of Healthcare of Russian Federation
Popikhalova E.B., PhD, senior research officer of Central Research Laboratory of SBEU HPE Saratov State Medical University n.a. V.I. Razumovsky of Ministry of Healthcare of Russian Federation


Similar Articles


Бионика Медиа