Введение

Недостаточное понимание конкретных механизмов инициации воспалительной реакции при хроническом обструктивном пиелонефрите (ХОПН), принципов формирования межклеточной кооперации, поддерживающей и ограничивающей воспаление, сложности прогнозирования альтерации и репарации тканей почки ограничивает возможности ранней диагностики и лечения рецидива заболевания [1]. Взаимодействие между клетками крови в виде клеточных агрегатов наблюдается при различных физиологических и патологических состояниях, сопровождаются морфологическими и функциональными изменениями тромбоцитов (Тц) и лейкоцитов [2]. Характеристики тромбоцитарно-лейкоцитарных агрегатов (ТЛА) циркулирующей крови продолжают обсуждаться в контексте поиска информативных маркеров развития воспаления [3], что позволило бы приблизиться к возможности ограничения развития воспалительной реакции на самых ранних этапах. Одним из подходов к решению данной проблемы является анализ реактивности Тц in vitro, поскольку последние вовлечены не только в реализацию гемостаза, но и в инициацию, прогрессирование и лимитирование воспалительного процесса [4].Тем не менее вопросы, каким образом оценить провоспалительную активность Тц и можно ли использовать в качестве индикатораТЛА для оценки динамики воспаления при ХОПН, остаются открытыми. В этом контексте представляет интерес фактор активации тромбоцитов (ФАТ), который секретируется активированными лейкоцитами и считается паракринным стимулятором Тц при воспалении [5].

Известно, что ФАТ обеспечивает взаимодействие нейтрофилов (Нф) и Тц в реализации воспаления [6]. Однако остается малоизученной роль ФАТ в формировании ТЛА при развитии воспаления. Исследование взаимодействия клеток крови могло бы пролить свет на механизмы перехода фазы ремиссии в фазу рецидива ХОПН.

Цель исследования – оценить in vitro реактивность тромбоцитов к ФАТ и их возможности к формированию тромбоцитарно-лейкоцитарных агрегатов на фоне применения нестероидных противовоспалительных препаратов и антибиотиков у пациентов с хроническим обструктивным пиелонефритом.

Материал и методы

В исследование включены 43 пациента с хроническим обструктивным пиелонефритом, который был верифицирован на основании жалоб больных, анамнеза заболевания, объективного осмотра, результатов клинико-лабораторных и инструментальных исследований. В фазе ремиссии ХОПН обследованы 26 больных, в фазе рецидива – 17. Пациенты в фазе ремиссии ХОПН принимали нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) и антибиотики в стандартной дозе не менее 5–10 дней до момента госпитализации, связанной с необходимостью проведения литотрипсии. Пациентам в фазе рецидива ХОПН назначали стандартную противовоспалительную терапию и исследования проводили через 5–10 дней. Из цитратной периферической крови пациентов Тц выделяли путем центрифугирования. Для анализа реактивности Тц использовали ФАТ в концентрации ЕС50 (150 мкМ), воспроизводящей у здоровых лиц амплитуду агрегации на уровне 50±5%. Оценку агрегации тромбоцитов (АТц) проводили на агрегометре ChronoLog (USA). Формирование ТЛА моделировали in vitro в условиях инкубации ФАТ-стимулированных тромбоцитов с интактными лейкоцитами. Количество интактных и стимулированных ТЛА оценивали после окраски мазков крови по методу Романовского–Гимзе. Учитывали следующие параметры: количество ТЛА (на 100 лейкоцитов); состав лейкоцитов, вовлеченных в формирование агрегатов (на 100 лейкоцитов); соотношение основных типов агрегатов: тромбоцитарно-нейтрофильных (ТНфА), тромбоцитарно-моноцитарных (ТМА) и тромбоцитарно-лимфоцитарных агрегатов (ТЛфА). Все клинические исследования выполнены по согласованию с комиссией по биоэтике Донецкого национального медицинского университета им. М. Горького. Статистическую обработку результатов проводили в пакетах MedStat и MedCalc. Достоверность полученных результатов подтверждалась путем статистической обработки с помощью вариационного регрессионного однофакторного дисперсионного анализа. Оценивали характер распределения признака, среднее арифметическое значение или медиану, стандартную ошибку, среднее отклонение, коэффициенты корреляции, критерии регресса и дисперсии. При анализе межгрупповых различий в зависимости от характера распределения признаков учитывали критерий Стьюдента и Вилкоксона. Различие оценивали как статистически значимые при p<0,05.

Результаты

Достижение поставленной цели возможно путем решения ряда исследовательских вопросов.

Во-первых, отличается ли реактивность Тц к ФАТ у пациентов в фазах ремиссии и рецидива ХОПН на фоне применения НПВП и антибиотиков? В обеих группах, если судить по ответу Тц на ФАТ, имеет место остаточная гипореактивность. У пациентов в фазе ремиссии ХОПН агрегация тромбоцитов составила 18,7±1,2% (95% ДИ – 16,1–21,3%), в фазе рецидива заболевания – 34,1±1,1% (р<0,001), т.е. при наличии острой воспалительной реакции в мочевыводящих путях реактивность Тц была в 1,82 раза выше. Обращает на себя внимание вариабельность ФАТ-индуцированной агрегации в фазе ремиссии ХОПН – от 7,9% до 30,4%. Дополнительно проведенный анализ реактивности Тц у больных в фазе ремиссии ХОПН позволил распределить вариационный ряд агрегатограмм на две подгруппы: А (n=10 пациентов), в которой агрегация Тц составила 25,2±0,9% (95% ДИ – 23,1–27,3%), и Б (n=16 пациентов) – 14,7±1,0% (95% ДИ – 12,5–16,8%) (р<0,001). Таким образом, на фоне применения НПВП и антибиотиков пациентами с фазой рецидива ХОПН остаточная реактивность Тц выше, чем в фазу ремиссии заболевания. Для фазы ремиссии характерна вариабельность реактивности Тц на ФАТ. Поскольку ФАТ является провоспалительным агонистом для Тц, наличие различной остаточной реактивности Тц может свидетельствовать об особенностях взаимодействия Тц и лейкоцитов при хроническом воспалении. Результатом такого взаимодействия может быть изменение количества и состава ТЛА, обеспечивающих реализацию воспаления при ХОПН.

Во-вторых, отличается ли количество тромбоцитарно-лейкоцитарных агрегатов (ТЛА)и соотношение клеток в агрегатах крови при ремиссии и рецидиве ХОПН, если имеет место гипореактивность Тц? Результаты исследования показали, что общее количество ТЛА в фазе рецидива ХОПН на 29,8% больше, чем в фазе ремиссии (соответственно 3,295±0,183% и 2,630±0,116%; р<0,001). В фазу рецидива спектр ТЛА был представлен всеми исследованными лейкоцитами. Так, в мазках крови выявлены:ТНфА – 2,353±0,331%, ТМА – 0,765±0,265%, ТЛфА – 0,059±0,019%, и тромбоцитарно-эозинофильные агрегаты (ТЭоА) – 0,118±0,080%. В фазу ремиссии ХОПН агрегаты были представлены ТНфА, ТМА и ТЛфА соответственно 2,000±0,288%, 0,538±0,116% и 0,090±0,022%. Количественный состав агрегатов в фазу рецидива и ремиссии статистически значимо не различался, однако выявляется тенденция к увеличению численности нейтрофилов и моноцитов, участвующих в формировании ТЛА при рецидиве ХОПН. Более демонстративным оказалось отношение ТНфА/ ТМАв крови, которое составило соответственно3,1 и 3,72. Таким образом, гипореактивные Тц принимают участие в формировании ТЛА. Общая численность и состав ТЛА отражают взаимодействие клеток крови при реализации хронической и острой воспалительной реакции.

В-третьих, отличается ли количество ТЛА и соотношение клеток в агрегатах крови у пациентов в фазе ремиссии ХОПН при различной остаточной реактивности Тц к ФАТ? У пациентов подгруппы А после стимуляции Тц с помощью ФАТ общее количество ТЛА в мазках крови на 17,2% больше, чем в подгруппе Б (соответственно 4,555±0,209% и 3,887±0,012%; р=0,040).При этом в подгруппе А выявлено большее количество ТНфА по сравнению с подгруппой Б (на 29,2%; р<0,01;соответственно 3,603±0,177% и 2,788±0,091%). В подгруппе А имело место увеличение количества ТМА по сравнению с подгруппой Б на 71,3% (р=0,044). Соотношение ТНфА/ТМА в подгруппе А составило 4,98, тогда как в подгруппе Б – 6,62.В подгруппе Б после стимуляции Тц сформировалось больше ТЛфА по сравнению с подгруппой А (в 2,96 раза; р<0,001), соответственно 0,678±0,141%и 0,299±0,087%. При этом отношение ТНфАТЛА составило в подгруппе Б 4,11, а подгруппе А – 15,73.Таким образом, в фазе ремиссии ХОПН выявлена зависимость количества ТЛА и соотношения клеток в агрегатах от остаточной реактивности Тц к ФАТ.

Обсуждение

До настоящего времени остаются непонятными механизмы активации циркулирующих в кровотоке лейкоцитов при развитии воспалительной реакции, хотя взаимодействие лейкоцитов и Тц считается признанным фактом [7]. Можно предположить, что развитие воспаления с участием Тц сопровождается формированием циркулирующих ТЛА и секрецией микрочастиц, которые являются индуктором и модуляторм развития воспалительной реакции [8]. Вызывают интерес и механизмы стимуляции самых Тц при воспалении; полагают, чт ведущую роль в этом процессе играют нейтрофилы, секретирующие ФАТ [9]. Высокую склонность Тц к агрегации при наличии воспаления и чувствительность Тц к ФАТ впервые отметили [10]. Расшифровка механизмов такой реактивности Тц обнаружила повышение продукции тромбоксана В2 (Т×В2) и 12-гидроксией козатетраеновой кислоты (12-НЕТА).

Выявленное нами участие ФАТ в активации Тц после блокады ЦОГ-1 тромбоцитов и ЦОГ-2 лейкоцитов (в результате назначения больным различных противовоспалительных препаратов и антибиотиков) свидетельствует, во-первых, о сохранении остаточной реактивности Тц на ФАТ, что создает основу для восстановления их функциональной активности; во-вторых, подтверждает возможность стимуляции Тц лейкоцитами при наличии воспалительной реакции у пациента. По сути, можно говорить о феномене прекондиционирования Тц лейкоцитами, которые находятся на разных стадиях активации при ХОПН. Причем наличие прекондиционированных Тц в фазе ремиссии ХОПН может быть фактором риска индукции острой воспалительной реакции в МВП. Установлено, что прекондиционованныеТц реагируют даже на подпороговые стимулы, быстро опустошаются, изнашиваются и тем самым способствуют ускоренному тромбопоэзу и выбросу новых гиперреактивных Тц [11].

Обращает на себя внимание, что у пациентов в фазе ремиссии ХОПН имеет место вариабельность количества и состава ТЛА. У ряда больных с более высокой остаточной реактивностью Тц (подгруппа А) при стимуляции ФАТ формируются ТЛА, в составе которых доминируют нейтрофилы и моноциты. A. Zarbock и соавт. [12] считают, что агрегация Тц с нейтрофилами способствует в первую очередь рекрутированию нейтрофилов в очаг воспаления. Взаимодействие нейтрофилов с Тц опосредовано в основном P-селектином, β2- и β3-интегринами (CD11b/CD18, CD41/CD61) [13]. Кроме того, Тц способствуют вторичной активации нейтрофилов и других лейкоцитов. Это связано с тем, что Тц секретируют биологически активные вещества, индуцирующие продукцию цитокинов нейтрофилами и эндотелиальными клетками. Ранее M.J. Peters и соавт. [14] установили, что при наличии воспаления агрегаты представлены субпопуляцией нейтрофилов, имеющих значительный потенциал фагоцитоза и продукции активных радикалов кислорода. Таким образом, Тц могут рассматриваться как важные амплифайеры острого воспаления.

A. Nagasawa и соавт. [15] утверждают, что у здоровых людей при активации тромбоцитов агонистами в основном образуются моноцит-тромбоцитарные агрегаты. Исследования, касающиеся механизмов формирования и значения тромбоцит-моноцитарных агрегатов, свидетельствуют, что образование таких агрегатов обеспечивается путем активации тромбоцитарных рецепторов CD41 (гликопротеина IIb–IIIa) и рецепторов моноцитов CD142 и CD162 [16]; процесс индуцируется АДФ и тромбином, а ингибируется аденозином. Адгезия Тц к моноцитам и нейтрофилам обеспечивает связывание лейкоцитами тканевого фактора, фактора свертывания Хагемана и фибриногена [17]. Таким образом, наличие ТМА у пациентов с ХОПН, вероятно, отражает включение моноцитарных механизмов ограничения острой воспалительной реакции. Остается малоизученным провоспалительное действие активированных Тц, которое может реализовываться путем взаимодействия с лейкоцитами. В настоящее время установлено [18], что активация Тц индуцирует провоспалительный фенотип циркулирующих моноцитов [CD14 (+) CD16 (+)]. Эти моноциты обладают повышенной адгезией к эндотелию и участвуют в формировании моноцитарно-тромбоцитарных агрегатов. Нельзя исключать, что увеличение количества ТМА при гипореактивности Тц направлено на восстановление их функциональной активности посредством секреции БАВ провоспалительным фенотипом моноцитов; целью такого взаимодействия могло бы быть рекрутирование Нф из крови для обеспечения фагоцитоза.

У части пациентов, находящихся в фазе ремиссии ХОПН при стимуляции гипореактивных тромбоцитов, обнаружено увеличение количества ТЛА, однако в их составе доминировали тромбоцитарно-лимфоцитарные агрегаты. Значимость данного явления для понимания механизмов исхода хронической воспалительной реакции не получила должного отражения в литературе. Образование агрегатов Тц с лимфоцитами связано с активацией тромбоцитов; подавляется при блокаде P-селектина, рецепторов GPIIb/IIIa, CD11b или CD40L. В свою очередь активация Т-лимфоцитов усиливала формирование агрегатов с Тц. В последние годы формируется убеждение, будто Тц являются регулятором иммунных реакций. Основание для таких заключений: (а) наличие в Тц факторов роста, цитокинов и хемокинов, которые активно влияют на элементы иммунной системы; (б) присутствие Toll-like-рецепторов (TLR) на поверхности Тц, что объясняет их активацию и участие в иммунном ответе [19]. Более того, M.R. Thomas и соавт. [20] признают критическую роль Тц в развитии воспаления и модуляции иммунных реакций. S.C. Starossom и соавт [21] удалось уточнить модулирующую роль Тц. Оказалось, что в начале воспаления Тц секретируют фактор тромбоцитов-4 и ФАТ, которые специфически стимулируют дифференцировку Т-клеток в направлении Тh-1, Тh -17 и CD4 Т-клеток, продуцирующих интерферон-γ/интерлейкин-17. На более поздних стадиях воспаления увеличивалась способность Тц образовывать агрегаты с CD4 Т-клетками. Формирование агрегатов обеспечивалось связыванием CD62P на тромбоцитах с адгезивной молекулой CD166 на поверхности Т-хелперов. Такое взаимодействие способствовало снижению активации CD4 T-клеток, их пролиферации и секреции интерферона-γ, что ограничивало воспалительную реакцию.

Заключение

На фоне применения НПВП и антибиотиков у пациентов с ХОПН отмечается гипореактивностьТц к провоспалительному медиатору ФАТ. У пациентов в фазу рецидива ХОПН остаточная реактивность Тц – выше, чем в фазу ремиссии заболевания, при этом формируются преимущественно тромбоцитарно-нейтрофильные и тромбоцитарно-моноцитарные агрегаты. Для фазы ремиссии ХОПН – характер на вариабельность реактивности Тц на ФАТ, отражающей особенности реализации хронической воспалительной реакции. Увеличение количества агрегатов, обеспечивающих рекрутирование нейтрофилов и моноцитов в очаг воспаления при ремиссии ХОПН, может быть предиктором перехода хронического воспаления в острую фазу.