Protein Ki-67 and collagen iv in diagnosis in prostatic neoplasms


I.I. Babichenko, P.I. Motin, S.A. Pulbere, A.V. Loctev, P.I. Talberg, M. Abud

Anatomic pathology chair, FSBEU HPE RUDN; SBUH State clinical hospital #29 of Department of Healthcare of Moscow City; Chair of urology and operative nephrology with oncourology course, FSBEU HPE RUDN
Aim. Assessment of prostatic expression of protein Ki-67 and collagen IV in benign prostatic hyperplasia and prostatic cancer.
Methods. Specimes of prostatic tissue of 53 patients (age 52–83 years) with prostatic adenocarcinoma and 10 – with benign prostatic hyperplasia were analysed. All patients were biopsied in 2010–2014 years.
Results. High expression of collagen IV was found in benign prostatic hyperplasia, in prostatic adenocarcinoma expression of collagen IV was low. Glisson scale stage corellated with cell proliferation index according to Ki-67 expression (rs =0,674).
Conclusion. Measurement of Ki-67 expression can be used in differential diagnosis between benign prostatic hyperplasia and prostatic adenocarcinoma.

ВВЕДЕНИЕ

Доброкачественная гиперплазия предстательной железы (ДГПЖ) и рак предстательной железы (РПЖ) являются двумя наиболее распространенными урологическими заболеваниями, влияющими на мужское здоровье в течение жизни. За последние десятилетия в большинстве стран мира отмечается выраженная тенденция к распространению ДГПЖ, что обусловлено старением населения и, соответственно, увеличением доли мужского населения старших возрастных групп [1]. По официальным данным, заболеваемость ДГПЖ с начала века выросла в России в 1,5 раза, составив к 2009 г. 2221,5 на 100 тыс. взрослого мужского населения [2]. РПЖ в настоящий момент занимает второе место по распространенности злокачественных новообразований и является второй по распространенности причиной смерти мужчин в США и многих западных индустриальных странах. В 2012 г. в США 241,740 мужчины был установлен диагноз рака простаты и 28,170 – погибли от него [3]. РПЖ широко распространен в России, характеризуется высокими темпами роста заболеваемости и смертности. Последняя обусловлена поздней диагностикой и множеством наблюдаемых пациентов с местнораспространенными и диссеминированными формами РПЖ [4]. Поэтому разработка и внедрение в клиническую практику программ ранней диагностики РПЖ служат не только важной медицинской, но и большой социальной и экономической задачей государственного значения. Существующие методы диагностики и стадирования РПЖ, такие как пальцевое ректальное исследование (ПРИ), трансректальное ультразвуковое исследование (ТРУЗИ), магнитно-резонансная томография (МРТ) и биопсия предстательной железы, не всегда могут дать четкий ответ о наличии и характере течения РПЖ. До недавнего времени считалось, что проблему точной диагностики РПЖ решает определение простатспецифического антигена (ПСА), однако в настоящее время найдены убедительные данные о недостаточной диагностической значимости этого маркера [5]. В связи с этим существует необходимость в разработке новых методов ранней диагностики и прогнозирования течения РПЖ. Ki-67 является маркером пролиферативной активности клеток, экспрессию этого ядерного белка многие исследователи считают прогностическим фактором для большинства опухолей, включая и рак предстательной железы [6]. Коллаген IV – основной компонент базальной мембраны эпителиальных клеток, он также встречается в стенке артериальных сосудов и собственном веществе соединительной ткани. Инвазивные свойства опухолевых клеток связаны с разрушением этого важного компонента соединительной ткани.

В настоящем исследовании изучалось распределение коллагена IV и белка Ki-67 в базальной мембране и строме различных опухолевых образований – от доброкачественной гиперплазии предстательной железы до аденокарциномы 5-й градации по шкале Глисона.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В работе был использован операционный материал 53 пациентов c диагнозом «аденокарцинома предстательной железы», средний возраст больных составил 67 с интервалом от 52 до 83 лет. В качестве контроля использован биопсийный материал 10 пациентов той же возрастной группы с диагнозом «доброкачественная гиперплазия предстательной железы».

Гистологическая оценка новообразований выполнена с использованием баллов шкалы Глисона, которое соответствовало наиболее выраженным анапластическим изменениям клеток опухолевых желез, выявленных при биопсии у данного пациента.

Иммуногистохимическое исследование проведено в соответствии со стандартным протоколом. Ткани фиксировали в 10 %-ном забуференном формалине (рН – 7,4) и заливали в парафин. Использован парафин с температурой плавления +54°С.

Нарезали серийные срезы толщиной 5 мкм и наклеивали на поли-L-лизиновые стекла. Депарафинизация выполнена в термостате при температуре +60°С в течение часа. После погружения в ксилол срезы регидрировались проводкой по спиртам в убывающей концентрации в течение 15 минут.

Восстановление антигенной активности осуществлено методом теплового демаскирования в 0,01 М-цитратном буфере в мини-автоклаве DAKO либо в 6,6 %-ном растворе Proteinas K (Novocastra) при исследовании коллагена IV.

Блокирование эндогенной пероксидазной активности выполнено с помощью 3 %-ной перекиси водорода в течение 10 минут.

В работе использованы следующие антитела к антигенам человека:

  • моноклональные мышиные антитела к белку Ki-67 (MM1, Diagnostic Biosystems, 1 : 200);
  • моноклональные мышиные антитела к коллагену IV (PHM-12, Thermoscientific, 1 : 100).

Для проведения иммуногистохимической реакции на срезы наносили 50 мкл разведенной первичной сыворотки. Срезы инкубировались при 37°С в течение 30 минут. Выявление иммунных комплексов проведено при помощи безбиотиновой системы детекции на основе пероксидазы хрена (N-Histofine, Япония).

После каждой инкубации срезы отмывали в фосфатно-солевом буфере, подсушивали вокруг, затем для визуализации реакции на них наносили ДАБ (3,3-диаминобензидин), что позволяло получать специфическую коричневую окраску. Интенсивность иммуногистохимической реакции в каждом препарате контролировалась под микроскопом: после достижения необходимой интенсивности окрашивания срезы отмывали в дистиллированной воде, а затем в течение 3 минут докрашивали гематоксилином Майера.

В качестве индикатора пролиферативной активности использован индекс пролиферации Ki-67 (ИП Ki-67), который определялся долей интенсивно окрашенных ядер при учете 300 клеток, выраженной в %.

Распределение коллагена IV в базальной мембране желез простаты оценивали полуколичественным методом по следующим показателям: 0 – отсутствие коллагена вдоль базальной мембраны, 1– наличие тонкой полоски коллагена, 2 – толстая полоска коллагена вдоль базальной мембраны, сравнимая по толщине и интенсивности окрашивания стенки сосудов.

Фотографирование объектов проведено с помощью бинокулярного микроскопа Axiostar plus (Carl Zeiss, Германия) и цифровой видеокамеры для микроскопии AxioCam MRc 5 (D) (Carl Zeiss, Германия). Полученные с помощью камеры изображения имели разрешение 2584 х 1936 точек (5 млн точек). Формат сохранения изображения *.jpg при увеличении х 200 или х 400.

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы STATISTICA 10.0. В таблицах приведены средние значения М + s, где s – среднее квадратичное отклонение. С учетом ненормального распределения полученных статистических показателей сравнение двух независимых групп осуществлено непараметрическим методом при помощи U-критерия Манна–Уитни. Достоверным считали различия средних при уровне статистической значимости p < 0,05. Корреляционные взаимоотношения между числом Глисона опухоли, ПСА, индексом пролиферации клеток и выраженностью экспрессии MMП-9 оценивали с помощью коэффициента корреляции Спирмена (rs).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

При иммуногистохимическом исследовании коллаген IV выявлен вдоль базальной мембраны железистых клеток в виде тонкой коричневой полоски различной интенсивности. Коллаген IV мелких артериол соединительнотканной стромы, как правило, окрашивает стенку сосудов в интенсивный коричневый цвет.

На рис. 1 представлена иммуногистохимическая реакция в соединительнотканной строме доброкачественной гиперплазии предстательной железы с антителами к коллагену IV (интенсивность – 2 балла), при этом видны толстые коричневые полоски коллагена IV, распределяющиеся вдоль базальной мембраны желез. Масса коллагена выявляется также в соединительнотканной строме простаты.

При исследовании распределения коллагена IV в препаратах с аденокарциномой предстательной железы интенсивность иммуногистохимического окрашивания зависела от градации опухоли по шкале Глисона. На рис. 2 представлена ИГХ-реакция в соединительнотканной строме аденокарциномы предстательной железы с 2-й градации по шкале Глисона, при этом интенсивность окраски менее выражена по сравнению с ДГПЖ и соответствует 1 баллу, однако тонкие волокна коллагена окружают отдельные клеточные элементы.

С увеличением числа Глисона более 3-й градации коллагеновые волокна полностью исчезают вокруг опухолевых клеток.

Для оценки пролиферативной активности был использован индекс пролиферации Ki-67, определенный отношением количества клеток с интенсивной ядерной реакцией на Ki-67 к общему числу клеток.

В контрольном материале, представленном доброкачественной гиперплазией предстательной железы, отдельные пролиферирующие клетки располагались только в базальном клеточном слое, пролиферативная активность клеток секреторного клеточного слоя не отмечена (рис. 3).

В аденокарциномах различных градаций в настоящем исследовании выявлен широкий спектр пролиферативной активности секреторных железистых клеток. При исследовании группы пациентов с опухолями 2-й градации по шкале Глисона пролиферативная активность секреторных опухолевых клеток (ИП Ki-67) составила 5,3 + 1,1 % (рис. 4, табл. 1).

Опухоли 3-й градации по шкале Глисона также характеризовались умеренной пролиферацией (7,2 ± 1,4 %).

В высокоинвазивных аденокарциномах 4-й и 5-й градаций нами отмечено увеличение пролиферативной активности атипических клеток (см. табл. 1, и рис. 4). В опухолях 4-й градации уровень пролиферации соответствовал 10,0 ± 3,9 %, а 5-й – 17,2 ± 9,4 %. Достоверные различия выявлены между всеми исследованными градациями опухолей за исключением низкодифференцированных аденокарцином, пролиферативная активность опухолей 4-й и 5-й градаций достоверно не различались (табл. 2).

В аденокарциномах различных градаций в настоящем исследовании выявлен широкий спектр пролиферативной активности секреторных железистых клеток. Достоверные различия выявлены между всеми исследованными градациями опухолей за исключением низкодифференцированных аденокарцином, пролиферативная активность опухолей 4-й и 5-й градаций достоверно не различалась. Проведенные исследования показали, что при доброкачественной гиперплазии предстательной железы высокая экспрессия коллагена IV, а в аденокарциноме предстательной железы коллаген IV разрушается за счет действия протеолитических ферментов.

Установлена умеренная положительная корреляционная связь между градацией по шкале Глисона и индексом пролиферации клеток по показателю Ki-67 (rs = 0,674). Нами установлено, что пролиферативная активность анапластических клеток аденокарциномы различных градаций по шкале Глисона, определяемая с помощью моноклональных антител Ki-67, является чувствительным тестом для дифференциальной диагностики этих новообразований, а при необходимости – высоконадежным методом дифференциальной диагностики между ДГПЖ и РПЖ.


About the Autors


Babichenko I.I., MD, PhD, Prof, head of anatomic pathology chair, FSBEU HPE RUDN
Motin P.I., head of urology department, SBUH State clinical hospital #29 of Department of Healthcare of Moscow City
Pulbere S.A., MD, PhD, assistant professor of chair of urology and operative nephrology with oncourology course, FSBEU HPE RUDN
Loctev A.V., research fellow of chair of urology and operative nephrology with oncourology course, FSBEU HPE RUDN
Talberg P.I., research fellow of chair of urology and operative nephrology with oncourology course, FSBEU HPE RUDN
Abud M., resident of chair of urology and operative nephrology with oncourology course, FSBEU HPE RUDN


Бионика Медиа