Русский
Расшифровка механизмов развития фиброза почек при сахарном диабете (СД) остается одной из актуальных задач фундаментальной и клинической нефрологии. Установлено, что накопление компонентов внеклеточного матрикса в клубочках и интерстиции почек, составляющее основу развития фиброза, начинается в первые годы течения СД - задолго до развития клинических проявлений диабетической нефропатии (ДН) [1]. Накопление компонентов матрикса возможно при усилении их синтеза и/или торможении распада. Доказано, что гипергликемия запускает синтез коллагена, протеогликанов, фибронектина и других компонентов матрикса в почках [2, 3]. Влияние СД на катаболизм внеклеточного матрикса почечной ткани менее изучено.
Ведущую роль в осуществлении катаболизма экстрацеллюлярного матрикса в нормальных и патологических условиях играют матриксные металлопротеиназы. В настоящее время известно более 30 металлопротеиназ. Наиболее изучены представители группы желатиназ: матриксная металлопротеиназа-2 (ММП-2) и матриксная металлопротеиназа-9 (ММП-9). Установлено, что их активность регулируется рядом ингибиторов, прежде всего тканевыми ингибиторами металлопротеиназ (ТИМП). Последние различаются по специфическому действию на ферменты. Так, ТИМП-1 наиболее активно ингибирует ММР-9, в то время как ТИМП-2 подавляет активность ММП-2. Важным блокатором активности металлопротеиназ является ингибитор активатора плазминогена 1-го типа (ИАП-1) [4, 5].
Целью исследования стало изучение мочевой экскреции матриксных металлопротеиназ (ММП-2, ММП-9) и их ингибиторов (ТИМП-1, ТИМП-2, ИАП-1) у больных СД 1 типа с различными стадиями ДН в сопоставлении с изменениями структуры, функции почек и качеством контроля гликемии.
Материал и методы
Обследованы 64 больных СД 1 типа - 32 мужчины и 32 женщины в возрасте от 16 до 49 лет (медиана 29 лет) с длительностью заболевания от месяца до 43 лет (медиана - 7 лет). Уровень гликированного гемоглобина А1с (HbA1с)варьировался от 4,8 до 17,1 % (медиана - 9,6 %). Большинство больных (56 человек; 87,5 %) имели неудовлетворительный контроль гликемии перед поступлением в клинику. В исследование не включали больных с кетоацидозом, патологией почек недиабетического генеза, хронической болезнью почек IV-V стадий, инфекцией мочевыводящих путей, с обострением сопутствующих заболеваний.
В зависимости от величины экскреции альбумина с мочой (ЭАМ) больные были распределены на 3 группы: с нормальной альбуминурией (25 пациентов; 1-я группа), с микроальбуминурией (30 человек; 2-я группа), с макроальбуминурией (9 больных; 3-я группа). Артериальная гипертензия зафиксирована у 7, 21 и 7 больных 1—3-й групп соответственно. У трех пациентов с макроальбуминурией выявлен нефротический синдром, у шести - снижение скорости клубочковой фильтрации (СКФ) менее 60 мл/мин/1,73 м2.
Всем пациентам проведено ультразвуковое исследование почек, определение суточной протеинурии, альбуминурии, исследование осадка мочи. СКФ рассчитана по формуле Кокрофта-Голта. В качестве маркера патологии канальцев почек определено содержание α1 -микроглобулина в моче. Для оценки процессов фиброзирования почек оценивали мочевую экскрецию коллагена IV типа, а также трансформирующего фактора роста β1 (ТФР-β1).
Определение содержания α1-микроглобулина, коллагена IV типа, ТФР-β1, ММП-2, ММП-9, ТИМП-1, ТИМП-2, ИАП-1 проведено в утренней порции мочи методом иммуноферментного анализа с использованием планшеточного ридера “BioRad 680” (фирма “BioRad”, США) и программного обеспечения “Zemfira”. Для определения α1-микроглобулина использованы коммерческие наборы “Immundiagnostik AG” (Германия), коллагена IV типа - “ATgutus Medical Ltd” (Ирландия), ТФР-β1 ММП-9 и ТИМП-1 - “Веndег MedSystems GmbH” (Австрия), ММП-2 и ТИМП-2 - “R&D Systems” (США), ИАП-1 - “Technoclone GmbH” (Австрия). Результаты приводили к величине экскретируемого креатинина и сравнивали со значениями в контрольной группе, состоявшей из 10 здоровых лиц без наследственной отягощенности по СД (3 мужчины, 7 женщин от 21 года до 50 лет).
Диагноз ДН был морфологически верифицирован 22 пациентам (7 с нормальной ЭАМ, 13 с микроальбуминурией и 2 с макроальбуминурией) при исследовании биоптатов почек с помощью световой и электронной микроскопии. Пункционная нефробиопсия проведена по клиническим показаниям с целью определения характера поражения почек при наличии повышенной ЭАМ или факторов риска ДН (артериальная гипертензия, диабетическая ретинопатия, длительность СД более 15 лет). Для количественной характеристики фиброза клубочков и интерстиция почек определены относительный объем мезангия клубочков и доля интерстиция в корковом веществе.
Проведение исследования одобрено локальным комитетом по этике. Пациенты давали письменное информированное согласие на участие в исследовании.
Статистическая обработка проведена с использованием пакета STATISTICA 6.0. Поскольку распределение большинства изученных признаков было отличным от нормального, применили методы непараметрической статистики. Межгрупповые различия оценивали с помощью критерия Манна-Уитни и ANOVA Краскела-Уоллиса. Взаимосвязь признаков изучена с помощью рангового корреляционного анализа Спирмена. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принят равным 0,05. Данные представлены как медианы, 25-е и 75-е процентили.
Результаты и обсуждение
Клинико-лабораторная характеристика групп представлена в табл. 1. Качество контроля гликемии достоверно не различалось в выделенных группах. Пациенты с макроальбуминурией ожидаемо отличались большей длительностью СД, более высокими показателями креатинина крови и меньшей СКФ.
Таблица 1.Характеристика групп больных СД 1 типа с разными стадиями ДН.
Примечание. Звездочки - достоверное различие: одна - с 1-й группой, две - с 1-й и 2-й группами больных.
Как видно из табл. 2, мочевая экскреция α1-микроглобулина была резко повышена у больных макроальбуминурией по сравнению с контролем (р = 0,0008); у пациентов с микроальбуминурией и нормальной ЭАМ наблюдалась тенденция к повышению показателя (р = 0,12, р = 0,07 соответственно). Экскреция коллагена IV типа достоверно превышала контроль в группах больных микро- и макроальбуминурией (р = 0,04 и р = 0,0008 соответственно). Аналогичные изменения обнаружены в экскреции ТФР-β1 (р = 0,01 и р = 0,004).
Таблица 2.Мочевая экскреция α1-микроглобулина, коллагена IV типа и ТФР-β1 у больных СД 1 типа с разными стадиями ДН.
Примечание. Звездочки - достоверное различие: одна - с 1-й группой, две - с 1-й и 2-й группами больных.
Содержание в моче матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов нарастало по мере увеличения выраженности нефропатии (табл. 3). Экскреция ММП-9 у больных с микроальбуминурией была выше, чем в контроле (р = 0,03). Повышение экскреции ММП-2 в этой группе не достигало степени статистической значимости по сравнению с контролем (р = 0,09). В группе больных с макроальбуминурией обнаружено достоверное увеличение экскреции ММП-2 (р = 0,001) и тенденция к повышению экскреции ММП-9 (р = 0,14).
Таблица 3.Мочевая экскреция матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов (пг/мкмоль креатинина) у больных СД 1 типа с разными стадиями ДН.
Примечание. Звездочки - достоверное различие: одна - с контролем, две - с контролем и 1-й группой, три - с контролем, 1-й и 2-й группами больных.
Резкое увеличение содержания ингибиторов металлопротеиназ зафиксировано у больных с макроальбуминурией: медианы экскреции ТИМП-1 и ИАП-1 в данной группе превышали таковые в контроле в 12,7 и 3,2 раза соответственно и были достоверно выше, чем в других группах обследованных (табл. 3). Медиана экскреции ТИМП-2 у больных с макроальбуминурией была повышена в 1,6 раза (различие с контролем недостоверно; р = 0,12). У пациентов с микроальбуминурией лишь экскреция ИАП-1 достоверно превышала контроль.
При ранговом корреляционном анализе (табл. 4) установлена прямая взаимосвязь между экскрецией ММП-2 и уровнем HbA1c. Корреляции остальных параметров с HbA1cоказались слабыми и недостоверными. Взаимосвязь с СКФ показала только экскреция ММП-9. Оба фермента и их ингибиторы прямо коррелировали с альбуминурией. ММП-2, ТИМП-1, ТИМП-2 и ИАП-1 продемонстрировали прямые взаимосвязи с содержанием α1-микроглобулина и коллагена IV типа. ММП-2 и ИАП-1 тесно коррелировали с ТФР-β1.
Таблица 4.Корреляции экскреции матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов с другими лабораторными параметрами у больных СД 1 типа.
Примечание. Звездочка - достоверность коэффициента корреляции < 0,05.
При морфологическом исследовании почек во всех случаях был подтвержден диагноз ДН. Увеличение объема мезангия клубочков зафиксировано у 15 больных, перигломерулярный склероз - у 10, склероз интерстиция - у 7 пациентов. Объем мезангия клубочков варьировался от 13,1 до 42,1 % (медиана - 24,2 %), доля интерстиция в корковом веществе - от 5,1 до 29,1 % (медиана - 9,4 %).
При сопоставлении экскреции металлопротеиназ и их ингибиторов с морфологическими изменениями в почках выявлена прямая корреляция между экскрецией ТИМП-1 и объемом мезангия клубочков (r = 0,44, р = 0,1). ТИМП-2 и ИАП-1 коррелировали с долей интерстиция в корковом веществе (r = 0,37, р = 0,1; r = 0,55, р = 0,01 соответственно).
Можно констатировать, что мочевая экскреция матриксных металлопротеиназ (ММП-2 и ММП-9) у больных СД 1 типа возрастает по мере увеличения выраженности почечного поражения. По нашим данным, выделение обоих ферментов положительно коррелирует с ЭАМ, кроме того, содержание в моче ММП-2 коррелирует с экскрецией α1-микроглобулина - маркером канальцевого поражения. Взаимосвязь между альбуминурией и экскрецией ММП-2 и ММП-9 у больных СД 1 типа отмечена также и другими авторами [6, 7]. У больных СД 2 типа найдена взаимосвязь между экскрецией ММП-9, альбуминурией [8, 9] и фильтрационной функцией почек [9].
Мочевая экскреция ингибиторов металлопротеиназ (ТИМП-1, ТИМП-2 и ИАП-1) также возрастала по мере увеличения тяжести ДН. Ранее М. Kanauchi и соавт. показали, что экскреция ТИМП-1 у больных с ДН коррелирует с альбуминурией и выраженностью поражения клубочков [10]. Данные об изменениях экскреции ТИМП-2 и ИАП-1 в зависимости от тяжести диабетической нефропатии ранее практически отсутствовали. Согласно полученным нами результатам, экскреция ТИМП-1, ТИМП-2 и ИАП-1 у больных СД 1 типа коррелирует с экскрецией маркеров дисфункции клубочков (альбумин) и канальцев (α1-микроглобулин).
Повышенная мочевая экскреция металлопротеиназ и их ингибиторов у пациентов с ДН может объясняться увеличением проницаемости почечного фильтра, ростом концентрации данных веществ в крови или увеличением их продукции в клетках клубочков и канальцев. Следует заметить, что степень изменений экскреции ММП-2, ММП-9 и их ингибиторов у обследованных больных ДН оказалась различной. Так, медиана экскреции ТИМП-1 у больных с макроальбуминурией была повышена относительно контроля в 12,7 раза, а медиана экскреции ТИМП-2 - только в 1,6 раза, несмотря на то что эти вещества имеют сходный молекулярный вес (28,5 и 21 кДа). Следовательно, только изменением проницаемости почечного фильтра нельзя объяснить обнаруженные изменения экскреции.
В ряде исследований зафиксировано повышение содержания металлопротеиназ в плазме крови при СД. В частности, найдено повышение уровня ММП-2 у больных СД 1 типа [6], ММП-9 - у пациентов с СД 2 типа [11]. В последнем случае повышение уровня ММП-9 оказалось предиктором микроальбуминурии. Уровень ИАП-1 у больных СД 1 типа с нефропатией был достоверно выше, чем у пациентов с нормоальбуминурией [12].
Экспериментальные исследования показали изменения синтеза и активности ММП-2, ММП-9, ТИМП-1 и ТИМП-2 в почках в условиях гипергликемии. Установлено, что в условиях избытка глюкозы экспрессия ММП-2 в мезангиоцитах может повышаться, однако процесс активации фермента замедлен [13]. В подоцитах высокая концентрация глюкозы увеличивает экспрессию и активность ММП-9 на 2-3-й день культивирования, однако после 5-го дня активность фермента снижается [14]. Снижение активности металлопротеиназ в условиях избытка глюкозы может быть результатом повышения продукции их ингибиторов. Показано, что глюкоза повышает экспрессию ТИМП-1 в мезангиоцитах [15], а также экспрессию ИАП-1 в фибробластах коркового вещества почки [16]. У крыс со стрептозотоциновым диабетом (модель СД 1 типа) обнаружено увеличение экспрессии в почках ТИМП-1 [17, 18], ТИМП-2 [18-20], ИАП-1 [18]. Повышение экспрессии ТИМП-2 в клубочках и канальцах почек положительно коррелировало с альбуминурией и отрицательно - с экспрессией ММП-2 [19].
Установлено, что в условиях гипергликемии в почках подавляется активность металлопротеиназ на фоне увеличения экспрессии их ингибиторов. Нами зафиксирована слабая взаимосвязь между экскрецией металлопротеиназ, ингибиторов металлопротеиназ и качеством контроля гликемии. Более тесно экскреция ферментов и ингибиторов (кроме ТИМП-2) коррелировала с ТФР-β. Данный фактор роста является основным фиброгеном в почках, через который гипергликемия реализует свой эффект на обмен внеклеточного матрикса [21]. Наиболее тесная взаимосвязь обнаружена между ТФР-β1 и ИАП-1. Данные медиаторы оказывают синергичный эффект на ремоделирование внеклеточного матрикса в “диабетических” почках [22].
Увеличение синтеза ингибиторов металлопротеиназ создает благоприятные условия для развития фиброза почек при СД. В свою очередь нокаутирование (“выключение”) гена ИАП-1 у мышей со стрептозотоциновым СД приводит к уменьшению синтеза коллагена I типа и фибронектина в мезангиальных клетках, тормозит развитие гломерулосклероза [22]. У мышей с отсутствием гена ИАП-1 не увеличивается альбуминурия, ниже уровень ТФР-β1 в корковом веществе почек по сравнению с животными с диабетом и сохранным синтезом ИАП-1 [23]. По нашим данным, резкое повышение экскреции ингибиторов металлопротеиназ (ТИМП-1, ТИМП-2 и ИАП-1) наблюдается среди больных СД с макроальбуминурией. Очевидно, активация синтеза ингибиторов металлопротеиназ определяет быстрое прогрессирование фиброза почек на этой стадии ДН.
С представлениями о роли ингибиторов металлопротеиназ в развитии фиброза почек согласуются зафиксированные нами прямые корреляции между мочевой экскрецией этих ингибиторов и маркерами фиброзирования почек (коллаген IV типа, ТФР-β1в моче), а также корреляции между экскрецией ТИМП-1 и объемом мезангия клубочков, между экскрецией ТИМП-2, ИАП-1 и долей интерстиция в корковом веществе. На взаимосвязь между изменениями продукции ингибиторов металлопротеиназ и нефросклерозом указывают и другие авторы. D. X. Lui и соавт. отметили, что у крыс со стрептозотоциновым СД отношение ММП-2/ТИМП-2 в клубочках и тубулоинтерстиции обратно связано с содержанием коллагена II типа [20]. По данным D. Suzuki и соавт., экспрессия ТИМП-1 в клубочках почек наиболее высока среди больных СД с начальной степенью расширения мезангия, по мере развития гломерулосклероза она снижается; экспрессия ТИМП-1 в тубулоинтерстиции коррелирует с выраженностью интерстициального фиброза [24].
Таким образом, определение мочевой экскреции матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов может использоваться в оценке ремоделирования внеклеточного матрикса и фиброгенеза в почках у больных СД. Для уточнения диагностической и прогностической значимости исследования металлопротеиназ и их ингибиторов при ДН необходимы дальнейшие исследования.
Таким образом, мочевая экскреция матриксных металлопротеиназ (ММП-2, ММП-9), а также их ингибиторов (ТИМП-1, ТИМП-2, ИАП-1) возрастает по мере увеличения выраженности нефропатии у больных СД 1 типа. Изменения экскреции матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов коррелируют с альбуминурией, мочевой экскрецией α1-микроглобулина, коллагена IV типа и ТФР-β1, а также с морфологическими параметрами почек, характеризующими развитие фиброза. Дисбаланс в системе металлопротеиназы/ингибиторы металлопротеиназ с повышением продукции ингибиторов может играть важную роль в формировании ДН.
Работа выполнена в рамках научного проекта, поддержанного грантом Президента Российской Федерации по государственной поддержке молодых российских ученых - докторов наук (грант МД-5725.2010.7).
