Введение
Ангиомиолипома – одна из наиболее типичных форм патологии почек при туберозном склерозе [1]. Туберозный склероз – генетически детерминированное заболевание, причиной которого являются мутации в генах супрессоров опухолевого роста TSC1 и TSC2. Мутации гена TSC2, по данным Каталога соматических мутаций в опухолях (Catalogue of Somatic Mutations in Tumors – COSMIC), выявляются в материале ангиомиолипом почки примерно в половине случаев [2].
Подавляющее большинство типов опухолей человека к настоящему времени достаточно подробно охарактеризовано с точки зрения спектра соматических мутаций, чего нельзя сказать о ангиомиолипомах почки, исследования мутационного профиля которых за пределами генов TSC1 и TSC2 практически не проводились.
Высокопроизводительное параллельное секвенирование ДНК – новый метод молекулярно-генетического анализа, позволяющий проводить одновременный поиск мутаций в значительном количестве генов. Мы впервые применили этот метод для поиска мутаций в опухолевом материале и лимфоцитах периферической крови больных ангиомиолипомой почки.
Материал и методы
В исследование включены 6 пациенток с ангиомиолипомой почки, которые проходили лечение в клинике урологии им. И.М. Сеченова. Возраст больных варьировался от 23 до 64 лет (средний возраст – 43,5 года), размер образования – от 37 до 77 мм (средний размер – 55,8 мм).
В пяти случаях проведено экзомное секвенирование ДНК из операционного материала опухолей, в одном случае – экзомное секвенирование ДНК из лимфоцитов периферической крови, поскольку операция не проводилась.
Скрининг мутаций в генах, вовлеченных в канцерогенез, проведен методом секвенирования нового поколения на платформе Ion Torrent PGM (Life Technologies, США). Протокол включает этапы подготовки библиотек фрагментов геномной ДНК, клональной эмульсионной ПЦР, секвенирования на геномном анализаторе и биоинформационного анализа результатов. Библиотеки фрагментов ДНК готовили, используя технологию Ion Ampliseq, представляющую собой ультрамультиплексную ПЦР (до 4000 пар праймеров в одной пробирке). Для проведения скрининга мутаций отобраны гены с наибольшими показателями частоты соматических мутаций в опухолях человека по данным каталога соматических мутаций COSMIC [2]. Каталог COSMIC составлен по результатам анализа 16 тыс. публикаций, описывающих соматические мутации в общей сложности 25 тыс. генов в различных типах опухолей. Для поиска мутаций в этой категории генов использован ранее разработанный набор праймеров Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel (Life Technologies). Ампликоны набора перекрывают подавляющую часть кодирующих областей 409 генов, вовлеченных в опухолеобразование.
Мультиплексную ПЦР и последующие этапы подготовки библиотек фрагментов генома проводили с использованием набора реактивов Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 (Life Technologies) по протоколу производителя. Аликвоты подготовленных библиотек подвергали клональной амплификации на микросферах в эмульсии на приборе Ion OneTouch с использованием набора Ion OneTouch 200 Template Kit v2 DL (Life Technologies). Эффективные продукты эмульсионной ПЦР – микросферы, покрытые целевыми ампликонами, очищали от пустых микросфер на приборе Ion OneTouch ES. Секвенирование проведено на геномном секвенаторе Ion Torrent PGM в чипах серии Ion 318 с использованием набора Ion PGM 200 Sequencing Kit (Life Technologies).
Результаты секвенирования анализировали с использованием программного обеспечения Torrent Suite в составе Base Caller (первичный анализ результатов секвенирования); Torrent Mapping Alignment Program – TMAP (выравнивание последовательностей относительно референсного генома NCBI build 37 – hg19); Variant Caller (анализ вариаций нуклеотидных последовательностей).
Аннотацию функционального значения генетических вариаций и фильтрацию известных полиморфизмов с использованием базы данных dbSNP провели с помощью компьютерной программы ANNOVAR [3]. При проведении биоинформационного анализа использовали базу данных dbSNP [4].
Визуальный анализ данных, ручную фильтрацию артефактов секвенирования и выравнивание последовательностей осуществили с использованием программы Integrative Genomics Viewer – IGV [5].
Для исключения артефактов геномного секвенирования и определения соматического или герминального характера мутаций провели валидацию мутаций, выявленных при скрининге. Применен метод прямого секвенирования индивидуальных ПЦР-продуктов с праймеров, фланкирующих области конкретных мутаций, на автоматическом генетическом анализаторе ABI PRISM 3100 (Life Technologies) по протоколам производителя.
Результаты
Экзомное секвенирование генов, вовлеченных в опухолеобразование, проведенное в 5 образцах ДНК опухолей, позволило выявить мутации в 30 генах из 409 исследованных: TSC2, ROS1, IGF2R, KMT2D, DICER1, MUTYH, MTR, CRBN, WHSC1, NCOA2, LAMP1, CCND2, MEN1, CASC5, CDH11, PTPRT, PAK3, RAD50, FGFR1, FANCA, TIMP3, STK36, ATR, WHSC1, FN1, PDGFRA, NUMA1, MAML2, CREBBP, ASXL1.
Мутации в гене TSC2 считаются патогномоничными для ангиомиолипомы. В нашем исследовании в 5 образцах опухолей нами выявлено три генетических варианта гена TSC2. В одном случае нонсенс-мутация (c.1111C>T, p.Q371*, 11 экзон гена), обнаруженная в материале опухоли, отсутствует в ДНК из лимфоцитов крови той же пациентки, что говорит о соматическом характере мутации. Эта мутация была описана ранее как патогенная [6]. Во втором случае миссенс-мутация c.C3275T, p.P1092L (28-й экзон гена), выявленная нами впервые, присутствует в ДНК, полученной как из опухоли, так и из лимфоцитов крови пациентки, что говорит о герминативном характере мутации и о развитии ангиомиолипомы на фоне туберозного склероза. В третьем случае выявлен герминативный интронный вариант гена TSC2, c.5260-15C>T, который описан в литературе и считается непатогенным [7].
Для пациентки, которой не проведено хирургическое вмешательство по поводу ангиомиолипомы почки, осуществлено секвенирование генов TSC1 и TSC2 в ДНК из лимфоцитов крови и обнаружена миссенс-мутация c.C320A: p.A107D в 4-м экзоне гена TSC2 (описана нами впервые). В этом случае также можно говорить о развитии ангиомиолипомы на фоне туберозного склероза.
Помимо мутаций в гене TSC2 наибольшее количество нуклеотидных замен в ДНК опухолей обнаружено в гене ROS1. Нами впервые описано две миссенс-мутации в гене ROS1 (c.A176G:p.Q59R, 3-й экзон; c.G2677T:p.G893C, 18-й экзон) и одна нонсенс-мутация (c.G2187A:p.W729*, 15-й экзон). Кроме того, в одной из опухолей выявлено наличие редкого, ранее описанного генетического варианта c.C1958T:p.S653F (rs34203286), популяционная частота которого составляет 0,4% [4].
Генетические варианты более в чем одном образце ДНК опухолей обнаружены нами также для генов LAMP1 (в двух опухолях) и RAD50 (также в двух опухолях). Все они представляют собой миссенс-мутации, причем три из четырех описаны нами впервые.
Кроме наличия редких вариантов в геномах изученных опухолей интересно отметить, что все обследованные пациентки с ангиомиолипомой почки являются носительницами полиморфизма в гене CYP2D6 (c.G1094A:p.R365H). Частота встречаемости этого однонуклеотидного полиморфизма в общей популяции составляет 9% [4].
Обсуждение
Нами впервые проведено параллельное секвенирование нескольких сотен генов, вовлеченных в опухолеобразование, в операционном материале ангиомиолипомы и в лимфоцитах периферической крови больных. Ранее для ангиомиолипомы изучался спектр соматических мутаций гена TSC2, повреждения которого ассоциированы с туберозным склерозом – генетическим заболеванием, наиболее частой патологией почек при котором является ангиомиолипома. Согласно опубликованным данным, выявляемость мутаций в гене TSC2 в ангиомиолипомах почки составляет 70% у больных туберозным склерозом и 20% – у больных сспорадическими ангиомиолипомами [8]. Мутации в других генах при ангиомиолипоме практически не изучались. Опубликовано два сообщения о мутациях гена TP53 в образцах злокачественной эпителиоидной ангиомиолипомы [9, 10]. Секвенирование гена рецептора эпидермального фактора роста EGFR показало отсутствие мутаций этого гена в ангиомиолипомах [11]. Описаний изучения мутационного спектра других генов в ангиомиолипоме в литературе и базах данных не найдено. Таким образом, мутационный ландшафт ангиомиолипомы практически не исследован, что отрицательно сказывается на изучении этиопатогенеза и эффективности разработки способов терапии, в т.ч. таргетной, этого заболевания.
Проведенное нами исследование, заключенное в параллельном секвенировании 409 генов, вовлеченных в онкогенез, в небольшой выборке пациенток с ангиомиолипомой (6 человек) впервые позволило бросить широкий взгляд на мутационные характеристики этих опухолей. Включение в список исследуемых генов TSC2 позволило сравнить получаемые нами результаты с ранее опубликованными. Патогенные мутации TSC2 обнаружены нами у 3 из 6 (50%) пациенток, что соответствует данным литературы. Например, Каталог соматических мутаций в опухолях COSMIC содержит сведения о секвенировании ДНК из 29 образцов ангиомиолипом, в 13 из которых (45%) выявлены мутации TSC2 [2].
Дополнительно к мутациям TSC2 в материале ангиомиолипом нами выялены мутации и/или крайне редкие полиморфные варианты в 30 генах из 409, отобранных по наибольшей частоте структурных нарушений в различных опухолях человека. Обнаруженные мутации находятся в генах, кодирующих транскрипционные факторы, белки клеточной адгезии, ферменты системы репарации повреждений ДНК, посттрансляционной модификации гистонов и ремоделинга хроматина, рецепторы и белки системы внутриклеточной передачи сигналов. В этом отношении геном ангиомиолипомы в определенной степени напоминает геном злокачественного новообразования, что является неожиданной находкой, требующей дальнейшего изучения.
Определенное нами 100%-ное носительство полиморфизма в гене CYP2D6 (c.G1094A:p.R365H) у больных ангиомиолипомами почки заставляет обратить внимание на роль соответствующего белка в этиопатогенезе заболевания, а также учитывать генетический статус CYP2D6 при назначении лекарственной терапии. Известно, что ангиомиолипомы чаще развиваются у женщин, чем у мужчин, при том что для туберозного склероза различий в частоте в зависимости от пола не выявлено [12]. Причины этого явления малоизучены. В некоторых исследованиях отмечается, что клетки ангиомиолипомы могут экспрессировать эстрогеновый рецептор [13]. Поскольку цитохром активно участвует в метаболизме гормонов, нельзя исключить значение функциональных полиморфизмов этого гена в определении предрасположенности к ангиомиолипоме. С другой стороны, некоторые лекарственные средства, применяемые в терапии ангиомиолипомы, являются ингибиторами CYP2D6, что следует учитывать при совместном назначении лекарственных средств.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Нами впервые проведено широкое мутационное профилирование ангиомиолипомы почки методом высокопроизводительного параллельного секвенирования ДНК. Наряду с мутациями в гене TSC2, как ранее описанными в литературе, так и выявленными впервые, обнаружены структурные нарушения в 30 генах белков, выполняющих ключевые функции в регуляции клеточного цикла и процессов дифференцировки тканей. Дальнейший поиск и характеристика мутаций в этих генах в расширенной выборке образцов внесут вклад в изучение биологии ангиомиолипомы почки и обеспечат основу для разработки новых способов профилактики и лечения этого заболевания.