Клиническая Нефрология » Опыт использования высокопроизводительного параллельного секвенирования ДНК для характеристики молекулярно-генетических особенностей ангиомиолипом почки

Опыт использования высокопроизводительного параллельного секвенирования ДНК для характеристики молекулярно-генетических особенностей ангиомиолипом почки

Е.Б. Кузнецова, К.М. Мосякова, А.С. Танас, М.С. Чаплыгина, Е.А. Алексеева, Е.В. Шпоть, К.И. Аношкин, Д.В. Залетаев, А.З. Винаров, В.В. Стрельников
1 ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» МЗ РФ, Москва; 2 ФБГНУ «Медико-генетический научный центр», Москва; 3 ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» МЗ РФ, НИИ уронефрологии и репродуктивного здоровья человека, Москва; 4 ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» МЗ РФ, Москва

Ангиомиолипома – одна из наиболее типичных форм патологии почек при туберозном склерозе. Поскольку туберозный склероз как генетическое заболевание ассоциирован с мутациями в генах TSC1 и TSC2, мутационное профилирование ангиомиолипом до сих пор также ограничивалось лишь этими двумя генами. Нами впервые проведен скрининг мутаций широкой панели генов, вовлеченных в опухолеобразование, в операционном материале и крови больных ангиомиолипомой методом высокопроизводительного параллельного секвенирования. Секвенирование ДНК опухолевых образцов выявило мутации в общей сложности в 30 из 409 исследованных генов. Выявлены мутации гена TSC2 как герминативной, так и соматической природы. Помимо TSC2 наибольшее количество нуклеотидных замен в ДНК опухолей обнаружено в гене ROS1. Интересно, что все обследованные нами пациентки являются носительницами полиморфизма в гене CYP2D6 (c.G1094A:p.R365H), частота встречаемости которого в общей популяции не превышает 10%. Дальнейший поиск и характеристика мутаций в расширенной выборке больных внесут вклад в изучение биологии ангиомиолипомы почки и обеспечат основу для разработки новых способов профилактики и лечения этого заболевания.

Ключевые слова: высокопроизводительное параллельное секвенирование ДНК, ангиомиолипома почки, туберозный склероз, мутация, генетический полиморфизм

Введение

Ангиомиолипома – одна из наиболее типичных форм патологии почек при туберозном склерозе [1]. Туберозный склероз – генетически детерминированное заболевание, причиной которого являются мутации в генах супрессоров опухолевого роста TSC1 и TSC2. Мутации гена TSC2, по данным Каталога соматических мутаций в опухолях (Catalogue of Somatic Mutations in Tumors – COSMIC), выявляются в материале ангиомиолипом почки примерно в половине случаев [2].

Подавляющее большинство типов опухолей человека к настоящему времени достаточно подробно охарактеризовано с точки зрения спектра соматических мутаций, чего нельзя сказать о ангиомиолипомах почки, исследования мутационного профиля которых за пределами генов TSC1 и TSC2 практически не проводились.

Высокопроизводительное параллельное секвенирование ДНК – новый метод молекулярно-генетического анализа, позволяющий проводить одновременный поиск мутаций в значительном количестве генов. Мы впервые применили этот метод для поиска мутаций в опухолевом материале и лимфоцитах периферической крови больных ангиомиолипомой почки.

Материал и методы

В исследование включены 6 пациенток с ангиомиолипомой почки, которые проходили лечение в клинике урологии им. И.М. Сеченова. Возраст больных варьировался от 23 до 64 лет (средний возраст – 43,5 года), размер образования – от 37 до 77 мм (средний размер – 55,8 мм).

В пяти случаях проведено экзомное секвенирование ДНК из операционного материала опухолей, в одном случае – экзомное секвенирование ДНК из лимфоцитов периферической крови, поскольку операция не проводилась.

Скрининг мутаций в генах, вовлеченных в канцерогенез, проведен методом секвенирования нового поколения на платформе Ion Torrent PGM (Life Technologies, США). Протокол включает этапы подготовки библиотек фрагментов геномной ДНК, клональной эмульсионной ПЦР, секвенирования на геномном анализаторе и биоинформационного анализа результатов. Библиотеки фрагментов ДНК готовили, используя технологию Ion Ampliseq, представляющую собой ультрамультиплексную ПЦР (до 4000 пар праймеров в одной пробирке). Для проведения скрининга мутаций отобраны гены с наибольшими показателями частоты соматических мутаций в опухолях человека по данным каталога соматических мутаций COSMIC [2]. Каталог COSMIC составлен по результатам анализа 16 тыс. публикаций, описывающих соматические мутации в общей сложности 25 тыс. генов в различных типах опухолей. Для поиска мутаций в этой категории генов использован ранее разработанный набор праймеров Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel (Life Technologies). Ампликоны набора перекрывают подавляющую часть кодирующих областей 409 генов, вовлеченных в опухолеобразование.

Мультиплексную ПЦР и последующие этапы подготовки библиотек фрагментов генома проводили с использованием набора реактивов Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 (Life Technologies) по протоколу производителя. Аликвоты подготовленных библиотек подвергали клональной амплификации на микросферах в эмульсии на приборе Ion OneTouch с использованием набора Ion OneTouch 200 Template Kit v2 DL (Life Technologies). Эффективные продукты эмульсионной ПЦР – микросферы, покрытые целевыми ампликонами, очищали от пустых микросфер на приборе Ion OneTouch ES. Секвенирование проведено на геномном секвенаторе Ion Torrent PGM в чипах серии Ion 318 с использованием набора Ion PGM 200 Sequencing Kit (Life Technologies).

Результаты секвенирования анализировали с использованием программного обеспечения Torrent Suite в составе Base Caller (первичный анализ результатов секвенирования); Torrent Mapping Alignment Program – TMAP (выравнивание последовательностей относительно референсного генома NCBI build 37 – hg19); Variant Caller (анализ вариаций нуклеотидных последовательностей).

Аннотацию функционального значения генетических вариаций и фильтрацию известных полиморфизмов с использованием базы данных dbSNP провели с помощью компьютерной программы ANNOVAR [3]. При проведении биоинформационного анализа использовали базу данных dbSNP [4].

Визуальный анализ данных, ручную фильтрацию артефактов секвенирования и выравнивание последовательностей осуществили с использованием программы Integrative Genomics Viewer – IGV [5].

Для исключения артефактов геномного секвенирования и определения соматического или герминального характера мутаций провели валидацию мутаций, выявленных при скрининге. Применен метод прямого секвенирования индивидуальных ПЦР-продуктов с праймеров, фланкирующих области конкретных мутаций, на автоматическом генетическом анализаторе ABI PRISM 3100 (Life Technologies) по протоколам производителя.

Результаты

Экзомное секвенирование генов, вовлеченных в опухолеобразование, проведенное в 5 образцах ДНК опухолей, позволило выявить мутации в 30 генах из 409 исследованных: TSC2, ROS1, IGF2R, KMT2D, DICER1, MUTYH, MTR, CRBN, WHSC1, NCOA2, LAMP1, CCND2, MEN1, CASC5, CDH11, PTPRT, PAK3, RAD50, FGFR1, FANCA, TIMP3, STK36, ATR, WHSC1, FN1, PDGFRA, NUMA1, MAML2, CREBBP, ASXL1.

Мутации в гене TSC2 считаются патогномоничными для ангиомиолипомы. В нашем исследовании в 5 образцах опухолей нами выявлено три генетических варианта гена TSC2. В одном случае нонсенс-мутация (c.1111C>T, p.Q371*, 11 экзон гена), обнаруженная в материале опухоли, отсутствует в ДНК из лимфоцитов крови той же пациентки, что говорит о соматическом характере мутации. Эта мутация была описана ранее как патогенная [6]. Во втором случае миссенс-мутация c.C3275T, p.P1092L (28-й экзон гена), выявленная нами впервые, присутствует в ДНК, полученной как из опухоли, так и из лимфоцитов крови пациентки, что говорит о герминативном характере мутации и о развитии ангиомиолипомы на фоне туберозного склероза. В третьем случае выявлен герминативный интронный вариант гена TSC2, c.5260-15C>T, который описан в литературе и считается непатогенным [7].

Для пациентки, которой не проведено хирургическое вмешательство по поводу ангиомиолипомы почки, осуществлено секвенирование генов TSC1 и TSC2 в ДНК из лимфоцитов крови и обнаружена миссенс-мутация c.C320A: p.A107D в 4-м экзоне гена TSC2 (описана нами впервые). В этом случае также можно говорить о развитии ангиомиолипомы на фоне туберозного склероза.

Помимо мутаций в гене TSC2 наибольшее количество нуклеотидных замен в ДНК опухолей обнаружено в гене ROS1. Нами впервые описано две миссенс-мутации в гене ROS1 (c.A176G:p.Q59R, 3-й экзон; c.G2677T:p.G893C, 18-й экзон) и одна нонсенс-мутация (c.G2187A:p.W729*, 15-й экзон). Кроме того, в одной из опухолей выявлено наличие редкого, ранее описанного генетического варианта c.C1958T:p.S653F (rs34203286), популяционная частота которого составляет 0,4% [4].

Генетические варианты более в чем одном образце ДНК опухолей обнаружены нами также для генов LAMP1 (в двух опухолях) и RAD50 (также в двух опухолях). Все они представляют собой миссенс-мутации, причем три из четырех описаны нами впервые.

Кроме наличия редких вариантов в геномах изученных опухолей интересно отметить, что все обследованные пациентки с ангиомиолипомой почки являются носительницами полиморфизма в гене CYP2D6 (c.G1094A:p.R365H). Частота встречаемости этого однонуклеотидного полиморфизма в общей популяции составляет 9% [4].

Обсуждение

Нами впервые проведено параллельное секвенирование нескольких сотен генов, вовлеченных в опухолеобразование, в операционном материале ангиомиолипомы и в лимфоцитах периферической крови больных. Ранее для ангиомиолипомы изучался спектр соматических мутаций гена TSC2, повреждения которого ассоциированы с туберозным склерозом – генетическим заболеванием, наиболее частой патологией почек при котором является ангиомиолипома. Согласно опубликованным данным, выявляемость мутаций в гене TSC2 в ангиомиолипомах почки составляет 70% у больных туберозным склерозом и 20% – у больных сспорадическими ангиомиолипомами [8]. Мутации в других генах при ангиомиолипоме практически не изучались. Опубликовано два сообщения о мутациях гена TP53 в образцах злокачественной эпителиоидной ангиомиолипомы [9, 10]. Секвенирование гена рецептора эпидермального фактора роста EGFR показало отсутствие мутаций этого гена в ангиомиолипомах [11]. Описаний изучения мутационного спектра других генов в ангиомиолипоме в литературе и базах данных не найдено. Таким образом, мутационный ландшафт ангиомиолипомы практически не исследован, что отрицательно сказывается на изучении этиопатогенеза и эффективности разработки способов терапии, в т.ч. таргетной, этого заболевания.

Проведенное нами исследование, заключенное в параллельном секвенировании 409 генов, вовлеченных в онкогенез, в небольшой выборке пациенток с ангиомиолипомой (6 человек) впервые позволило бросить широкий взгляд на мутационные характеристики этих опухолей. Включение в список исследуемых генов TSC2 позволило сравнить получаемые нами результаты с ранее опубликованными. Патогенные мутации TSC2 обнаружены нами у 3 из 6 (50%) пациенток, что соответствует данным литературы. Например, Каталог соматических мутаций в опухолях COSMIC содержит сведения о секвенировании ДНК из 29 образцов ангиомиолипом, в 13 из которых (45%) выявлены мутации TSC2 [2].

Дополнительно к мутациям TSC2 в материале ангиомиолипом нами выялены мутации и/или крайне редкие полиморфные варианты в 30 генах из 409, отобранных по наибольшей частоте структурных нарушений в различных опухолях человека. Обнаруженные мутации находятся в генах, кодирующих транскрипционные факторы, белки клеточной адгезии, ферменты системы репарации повреждений ДНК, посттрансляционной модификации гистонов и ремоделинга хроматина, рецепторы и белки системы внутриклеточной передачи сигналов. В этом отношении геном ангиомиолипомы в определенной степени напоминает геном злокачественного новообразования, что является неожиданной находкой, требующей дальнейшего изучения.

Определенное нами 100%-ное носительство полиморфизма в гене CYP2D6 (c.G1094A:p.R365H) у больных ангиомиолипомами почки заставляет обратить внимание на роль соответствующего белка в этиопатогенезе заболевания, а также учитывать генетический статус CYP2D6 при назначении лекарственной терапии. Известно, что ангиомиолипомы чаще развиваются у женщин, чем у мужчин, при том что для туберозного склероза различий в частоте в зависимости от пола не выявлено [12]. Причины этого явления малоизучены. В некоторых исследованиях отмечается, что клетки ангиомиолипомы могут экспрессировать эстрогеновый рецептор [13]. Поскольку цитохром активно участвует в метаболизме гормонов, нельзя исключить значение функциональных полиморфизмов этого гена в определении предрасположенности к ангиомиолипоме. С другой стороны, некоторые лекарственные средства, применяемые в терапии ангиомиолипомы, являются ингибиторами CYP2D6, что следует учитывать при совместном назначении лекарственных средств.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нами впервые проведено широкое мутационное профилирование ангиомиолипомы почки методом высокопроизводительного параллельного секвенирования ДНК. Наряду с мутациями в гене TSC2, как ранее описанными в литературе, так и выявленными впервые, обнаружены структурные нарушения в 30 генах белков, выполняющих ключевые функции в регуляции клеточного цикла и процессов дифференцировки тканей. Дальнейший поиск и характеристика мутаций в этих генах в расширенной выборке образцов внесут вклад в изучение биологии ангиомиолипомы почки и обеспечат основу для разработки новых способов профилактики и лечения этого заболевания.

Литература

1. Harabayashi T., Shinohara N., Katano H., Nonomura K., Shimizu T., Koyanagi T. Management of renal angiomyolipomas associated with tuberous sclerosis complex. J. Urol. 2004;171(1):102–105.

2. Forbes S.A., Beare D., Gunasekaran P., Leung K., Bindal N., Boutselakis H., Ding M., Bamford S., Cole C., Ward S., Kok C.Y., Jia M., De T., Teague J.W., Stratton M.R., McDermott U., Campbell P.J. COSMIC: exploring the world's knowledge of somatic mutations in human cancer. Nucleic Acids Res. 2015;43(D1):D805–D811.

3. Wang K., Li M., Hakonarson H. ANNOVAR: Functional annotation of genetic variants from next-generation sequencing data. Nucleic Acids Res. 2010;38:e164.

4. Sherry S.T., Ward M.H., Kholodov M., Baker J., Phan L., Smigielski E.M., Sirotkin K. dbSNP: the NCBI database of genetic variation. Nucleic Acids Res. 2001;29(1):308–311.

5. Robinson J.T., Thorvaldsdóttir H., Winckler W., Guttman M., Lander E.S., Getz G., Mesirov J.P. Integrative Genomics Viewer. Nature Biotechnology. 2011;29:24–26.

6. Rendtorff N.D., Bjerregaard B., Frödin M., Kjaergaard S., Hove H., Skovby F., Brøndum-Nielsen K., Schwartz M.; Danish Tuberous Sclerosis Group. Analysis of 65 tuberous sclerosis complex (TSC) patients by TSC2 DGGE, TSC1/TSC2 MLPA, and TSC1 long-range PCR sequencing, and report of 28 novel mutations. Human mutation. 2005;26(4):374–383.

7. Jansen F.E., Braams O., Vincken K.L., Algra A., Anbeek P., Jennekens-Schinkel A., Halley D., Zonnenberg B.A., van den Ouweland A., van Huffelen A.C., van Nieuwenhuizen O., Nellist M. Overlapping neurologic and cognitive phenotypes in patients with TSC1 or TSC2 mutations. Neurology. 2008;70(12):908–915.

8. Yang H.M., Choi H.J., Hong D.P., Joo S.Y., Lee N.E., Song J.Y., Choi Y.L., Lee J., Choi D., Kim B., Park H.J., Park J.B., Kim S.J. The analysis of mutations and exon deletions at TSC2 gene in angiomyolipomas associated with tuberous sclerosis complex. Exp. Mol. Pathol. 2014;97(3):440–444.

9. Li J., Zhu M., Wang Y.L. Malignant epithelioid angiomyolipoma of the kidney with pulmonary metastases and p53 gene mutation. World J. Surg. Oncol. 2012;10:213.

10. Kawaguchi K.I., Oda Y., Nakanishi K., Saito T., Tamiya S., Nakahara K., Matsuoka H., Tsuneyoshi M. Malignant transformation of renal angiomyolipoma: a case report. Am. J. Surg. Pathol. 2002;26(4):523–529.

11. Lim S.D., Kim W., Ahn G., Kwon G.Y. Protein expression and mutational analysis of epidermal growth factor receptor in renal angiomyolipomas. Pathol. Int. 2007;57(9):584–588.

12. Bissler J.J., Kingswood J.C. Renal angiomyolipomata. Kidney Int. 2004;66(3):924–934.

13. Logginidou H., Ao X., Russo I., Henske E.P. Frequent estrogen and progesterone receptor immunoreactivity in renal angiomyolipomas from women with pulmonary lymphangioleiomyomatosis. Chest. 2000;117(1):25–30.

Об авторах / Для корреспонденции

Информация об авторах:
Кузнецова Е.Б. – ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики человека ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» МЗ РФ, ведущий научный сотрудник лаборатории эпигенетики ФГБНУ МГНЦ, к.б.н.
E-mail: kuznetsova.k@bk.ru
Мосякова К.М. – младший научный сотрудник НИИ урологии и репродуктивного здоровья человека, аспирант кафедры урологии ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» МЗ РФ.
E-mail: cristina.imago27@yandex.ru
Танас А.С. – старший научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики человека ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» МЗ РФ, старший научный сотрудник лаборатории эпигенетики ФГБНУ МГНЦ, доцент кафедры медицинской и молекулярной генетики ГБОУ ВПО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова» МЗ РФ, к.б.н.
E-mail: tanas80@gmail.com
Чаплыгина М.С. – ординатор ФГБНУ МГНЦ.
E-mail: chaplygina.90@mail.ru
Алексеева Е.А. – научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики человека ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» МЗ РФ, научный сотрудник лаборатории эпигенетики ФГБНУ МГНЦ.
E-mail: katrina_5@inbox.ru
Шпоть Е.В. – заведующий отделом онкоурологии НИИ урологии и репродуктивного здоровья человека, доцент кафедры урологии ГБОУ ВПО «Первый МГМУ
им. И.М. Сеченова» МЗ РФ, к.м.н.
E-mail: shpot@inbox.ru
Аношкин К.И. – ГБОУ ВПО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова» МЗ РФ
Залетаев Д.В. – заведующий лабораторией молекулярной генетики человека ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» МЗ РФ, заведующий лабораторией эпигенетики ФГБНУ МГНЦ, профессор кафедры молекулярной биологии ГБОУ ВПО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова» МЗ РФ, д.б.н.
E-mail: zalnem@mail.ru
Винаров А.З. – профессор, заместитель директора по научной работе НИИ уронефрологии и репродуктивного здоровья человека ГБОУ ВПО «Первый МГМУ
им. И.М. Сеченова» МЗ РФ, д.м.н.
E-mail: avinarov@mail.ru
Стрельников В.В. – ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики человека ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» МЗ РФ, ведущий научный сотрудник лаборатории эпигенетики ФГБНУ МГНЦ, профессор кафедры медицинской и молекулярной генетики ГБОУ ВПО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова» МЗ РФ, д.б.н.
E-mail: vstrel@list.ru