Семейство матриксных металлопротеиназ

Матриксные металлопротеиназы (MMП) представляют собой семейство структурно связанных протеолитических ферментов, содержащих ион Zn2+ в активном центре. ММП секретируются разными клетками (фибробласты, макрофаги, гладкомышечные клетки сосудистой стенки, нейтрофилы, хондроциты, остеобласты и др.) и гидролизируют все компоненты экстрацеллюлярного матрикса (ЭЦМ): все коллагены и проколлагены, протеогликаны, эластин, фибронектин, ламинин, а также адгезивные и другие белки соединительной ткани [1, 2].

ММП играют важную роль во многих физиологических процессах, таких как эмбриональное развитие, морфогенез, репродукция и ремоделирование ткани, а также в различных патологических процессах. Изменение активности ММП (как увеличение, так и снижение) сопутствует многим заболеваниям человека (опухоли, фиброзирующие заболевания сердца, легких, печени и почек, артрит, язвенная болезнь желудка и т. д.).

Общая характеристика ММП и их ингибиторов

Большинство ММП секретируются как латентные проферменты. Отдельные представители ММП, связанные с клеточной мембраной, известные как ММП мембранного типа (МТ-МПП), секретируются в функционально активной форме [3]. Активация латентных про-МПП осуществляется под действием плазмина или других ММП [4–6].

В структуре всех ММП выделяют сигнальный пептид, необходимый для успешной секреции из клетки; пропептидный участок, при отщеплении которого ММП активируются; каталитический домен, имеющий координационные связи с катионом цинка каталитического центра, и шарнирный регион. Каталитический домен включает два иона Zn2+ и три иона Са2+. Все ферменты, кроме ММП-7, имеют концевой гемопексиноподобный домен, содержащий центр связывания субстрата. В ММП-2, -9 выявлен дополнительный участок включения в каталитическом домене, схожий с фибронектином 2-го типа, который, по-видимому, обеспечивает высокое сродство желатиназ к мембранным компонентам [6]. Пропептид содержит пептидную последовательность PRCGV/NPD, получившую название «цистеиновый выключатель», поскольку содержит SH-группу, которая, связываясь с атомом Zn2+ в активном центре, поддерживает молекулу ММП в форме зимогена (предшественника ММП неактивной формы). После гидролитического удаления пропептида и освобождения Zn2+-связывающего центра происходит активация ММП.

В настоящее время известно более 30 ММП, объединенных в 6 различных групп (табл. 1).

ММП различаются между собой по молекулярной структуре, субстратной специфичности и распределению в тканях. Наиболее изучены ферменты группы желатиназ – ММП-2 и ММП-9. Именно этим ферментам принадлежит ведущая роль в расщеплении коллагена IV типа, ламинина, некоторых хемокинов. ММП из группы коллагеназ участвуют в деградации коллагенов I, II, III типов. ММП мембранного типа являются рецепторами и активаторами других ММП и обеспечивают протеолиз в околоклеточном пространстве. Группа «других» ММП включает разные пептидазы, которые секретируются единичными типами клеток или экспрессируются в особых ситуациях [4, 7].

Основная биологическая функция ММП заключается в удалении компонентов внеклеточного матрикса. Металлопротеазы регулируют действие ростовых факторов: сосудистого эндотелиального фактора роста, рецептора фактора роста фибробластов, эпителиального фактора роста и инсулиноподобного фактора роста [8]. ММП-2, -3, -7, -9 способствуют активации трансформирующего фактора роста β, являющегося хемоатрактантом для моноцитов, высвобождая его из матрикса [9]. Отщепление CD44, опосредованное МТ1-ММП, ассоциировано с клеточной миграцией. Под воздействием протеолиза ММП некоторые компоненты внеклеточного матрикса начинают демонстрировать скрытые биологические функции: так, деградация коллагена 1-го типа коллагеназами ассоциирована с активизацией остеокластов [10].

Металлопротеиназы продуцируются нормальными или трансформированными клетками: нейтрофилами, моноцитами, макрофагами, фибробластами, остеокластами, хондроцитами, кератиноцитами, эндотелиальными и эпителиальными клетками [11].

Активность ферментов зависит от уровня экспрессии их генов и от наличия активаторов и ингибиторов. Экспрессия ММП сходна с экспрессией белков острой фазы. Транскрипцию и экспрессию ММП индуцируют интерлейкин-1, тромбоцитарный эндотелиальный фактор роста, эпидермальный фактор роста, фактор роста фибробластов, фактор роста гепатоцитов, фактор некроза опухоли-α, подавляет эти процессы трансформирующий фактор роста -β1 [1, 9, 12–14].

Регуляция активности ферментов на посттрансляционном уровне осуществляется активацией зимогенов или взаимодействием с тканевыми ингибиторами ММП (ТИММП) [6]. Предшественники ММП активируются в межклеточной среде преимущественно плазмином и другими протеиназами, в т. ч. и ММП, а также тиолмодифицирующими агентами (4-аминофенилмеркуриевый ацетат, HgCl2 и N-этималеимид). Низкая pH, гипертермия и ПОЛ также могут активировать металлопротеазы [3] .

Протеолитическая активность ММП зависит от взаимодействия факторов, способствующих активации латентных про-ММП (плазмин, система урокиназа/рецептор урокиназы), и факторов, ингибирующих эти процессы. Среди последних особое значение принадлежит тканевым ингибиторам матриксных металлопротеиназ (ТИМП) и ингибитору активатора плазминогена I типа (ПАИ-I) [1].

Естественные ингибиторы ММП подразделяются на тканевые и плазматические. Известно четыре представителя подкласса ТИМП. Как и ММП, они экспрессируются во всех органах и тканях. Хотя гены ТИМП обладают большим структурным сходством, для самих белков характерны специфические биохимические особенности и физиологические функции. Все ТИМП являются секретируемыми белками, но могут быть связанными с компонентами клеточных мембран. Для проявления ингибиторной активности ТИМП взаимодействуют с активным центром ММП, причем отвечает за это аминокислотная последовательность N-концевого домена, содержащая дисульфидные связи, которая обладает способностью вмешиваться в активные центры каталитического домена про-ММП. От С-терминальной части молекулы зависит специфичность связывания ТИМП с компонентами ЭЦМ.

В настоящее время хорошо изучены ТИМП-1, ТИМП-2, ТИМП-3 и ТИМП-4, которые различаются по специфическому действию на металлопротеиназы (табл. 2). Так, ТИМП-1 наиболее активно ингибирует ММP-9, в то время как ТИМП-2 подавляет активность ММП-2 [1].

Важным ингибитором ММП является ингибитор активатора плазминогена 1-го типа (ПАИ-1), способный блокировать активаторы плазминогена тканевого и урокиназного типов и препятствовать образованию плазмина. Блокируя плазминообразование, ПАИ-1 препятствует активации ММП. Другой механизм его подавляющего действия связан со способностью соединяться с активатором плазминогена урокиназного типа, что предотвращает индуцированную урокиназой активацию МТ-ММП, с помощью которой образуется функционально активная форма ММП-2 [3].

Другая группа ингибиторов ММП – это плазматические α-микроглобулины (ММП осуществляет их протеолиз, изменяя их конформацию). В результате ингибитор активируется и ковалентно связывается с ММП, после чего эти комплексы взаимодействуют с рецепторами, транспортируются внутрь клеток и разрушаются мегзином и другими ингибиторами [3, 15].

ММП и деградация ЭЦМ

Субстратная специфичность семейства ММП весьма вариабельна. Так, ММП-3, ММП-7 и ММП-10, относящиеся к классу стромелизинов, разрушают протеогликаны, фибронектин, коллагены, желатин [16]. ММП-11 взаимодействуют с ламинином и фибронектином [17]. Коллагеназы ММП-1, ММП-8 и ММП-13 лизируют как фибриллярные, так и нефибриллярные коллагены (I, II, III типов). Желатиназы ММП-2 и ММП-9 активно разрушают денатурированные коллагены. Кроме того, ММП-9 специфично взаимодействует с компонентами базальной мембраны – коллагеном IV типа и эластином, а ММП-2 в свою очередь – с коллагеном I типа [16, 18]. Мишенью ММП-12 является эластин и в меньшей степени – фибронектин [19].

Экспрессия и функции MMП и их ингибиторов в почках

В физиологических условиях в почках синтезируются ММП -2, -3, -9, -13, -14, -24, -25, -27, -28, а также ТИМП -1, -2 и -3, которые экспрессируются многими видами клеток: мезангиальными, эндотелиальными, эпителиальными, гладкомышечными, фибробластами, однако их распределение не всегда равномерно. ММП-2, -3 и -9 выявляются на протяжении всего нефрона (в клубочках, в проксимальных и дистальных канальцах, петле Генле, собирательных трубочках). ММП-13, -14, ТИМП-1 и -2 экспрессируются в основном в клубочках. Преимущественно канальцевую локализацию в ткани почки человека имеет ММП-24, а в ткани почки крыс – ММП-25, -27 и ТИМП-3. [1, 4, 7].

Функции ММП

Баланс между активностью ММП и их ингибиторов играет большую роль в эмбриональном развитии почек, в частности в нефрогенезе. Во «взрослых» почках ММП участвуют в ремоделировании внеклеточного матрикса, что важно для поддержания структурной и функциональной целостности клубочков и интерстиция. ММП регулируют обмен матрикса, катализируя распад его компонентов, а также изменяя активность факторов роста и сигнальных молекул [20]. Кроме того, ММП и их ингибиторы участвуют в регуляции апоптоза и пролиферативной активности нефроцитов. Нарушение баланса в системе ММП и их ингибиторов является одним из механизмов развития ряда острых и хронических заболеваний почек, поскольку в физиологических условиях в почке функционирует сбалансированная система ММП/ТИМП [4, 7, 21, 22].

Изменения ММП и ТИМП при наследственных заболеваниях почек: синдроме Альпорта и аутосомно-доминантной поликистозной болезни почек

Экспериментальные исследования на мышиной модели синдрома Альпорта, проведенные в начале века американскими учеными, не выявили влияния активности ММП на прогрессирование заболевания – по их мнению, наличие или отсутствие ММП-9 не влияет на прогрессирование синдрома Альпорта [23]. Но уже через 3 года появились работы, свидетельствующие о взаимосвязи изменений в системе ММП/ТИМП с течением синдрома Альпорта у животных (мыши, собаки).

В проведенной экспериментальной работе на собаках с синдромом Альпорта, которые страдали протеинурией и быстропрогрессирующей хронической почечной недостаточностью, в криосрезах почек выявлена повышенная активность ММП-2, -9 и -14, что предположительно отражает степень прогрессирования заболевания. Повышенная экспрессия ММП-2, -9 и -14 наблюдается в корковом веществе склерозированных почек собак с Х-сцепленным синдромом Альпорта. Эти результаты показывают, что ММП может играть важную роль в накоплении экстрацеллюлярного матрикса, связанного с прогрессирующим почечным фиброзом у этих животных [24]. Дальнейшие исследования в этом направлении показали, что у собак с синдромом Альпорта в отличие от здоровых животных кроме ММП-2 и -9 повышены экспрессия ММП-3 и -7 [25].

В эксперименте на моделях крыс с индуцированным синдромом Альпорта выявлено повышение ММП-1, -3, -9 при прогрессировании почечной дисфункции. Использование синтетических ингибиторов ММП у крыс с генетически подтвержденным синдромом Альпорта до появления протеинурии замедляло прогрессирование заболевания, в то время как использование этих препаратов на крысах с протеинурией приводило к ускорению прогрессирования заболевания, что было связано с обширным интерстициальным фиброзом и ранней гибелью мышей. Таким образом, оказалось, что синтетические ингибиторы ММП в протеинурической стадии синдрома Альпорта у крыс приводит к усилению интерстициального фиброза [26].

Повышенная активность ММП-2, -9 и -14 усугубляет прогрессирование синдрома Альпорта у мышей [27].

Известно, что прогрессирование синдрома Альпорта электронно-микроскопически характеризуется появлением участков утолщения и истончения ГБМ. V.N. Rao и соавт. (2006) выявили, что активность ММП-12 в клубочках мышей при этом заболевании в 40 раз выше, чем у здоровых мышей. Также она значительно повышена в индуцированных данным заболеванием клубочках мышей, собак и людей. Лечение мышей с наследственным нефритом ингибитором ММП (ММ1270), который блокирует ММП-12, приводило к восстановлению ультраструктуры ГБМ и ее функции. Аналогичный эффект получен и при использовании ингибитора рецепторов хемокинов СС2 (CCR2). Эти рецепторы обнаружены на подоцитах мышей с синдромом Альпорта. На основании полученных данных выдвинуто предположение, что в основе индукции ММП-12 может лежать MCP-1-активация CCR2 рецепторов на подоцитах. В противоположность этому терапия ингибиторами ММП, которые не действуют на ММП-12, не давала такого эффекта. В связи с этим авторы считают, что неравномерность ГБМ при синдроме Альпорта может быть опосредованна нарушением регуляции ММП, в частности ММП-12. А создание лекарственных средств на основе ингибиторов ММП-12/CCR2, возможно, поможет выработать новую стратегию терапии синдрома Альпорта [28]. Повышение индукции ММП при деформации подоцитов подтверждено и более поздними работами. Так, D.T. Meehan и соавт. (2009) показали, что у пациентов с синдромом Альпорта повышена индукция IL-6, ММП-3, -9, -10, -14, но не ММП-2 и -12, а у гипертензивных мышей с протеинурией наряду с гистологическими и ультраструктурными повреждениями ГБМ выявлено повышение IL-6, ММП-3, -10. В той же экспериментальной работе было показано, что при синдроме Альпорта нарушение регуляции системы ММП/ТИМП происходит в ответ на деформацию подоцитов, что может способствовать началу гломерулярных изменений при этой патологии и прогрессированию заболевания [29].

ММП при кистозах почек

Роль матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов в развитии и прогрессировании кистозных заболеваний почек изучается активно в течение последних 20 лет. Считается, что увеличение кист является следствием увеличения синтеза компонентов экстрацеллюлярного матрикса. Так, при аутосомно-доминантной поликистозной болезни почек (АДПКБ) клетки почечных канальцев содержат большее, чем в эпителии канальцев здоровой почки, количество структур экстрацеллюлярного матрикса [30]. А в регуляции синтеза экстрацеллюлярного матрикса (ЭЦМ), как показывают экспериментальные работы, участвует система ММП/ТИМП.

Так, еще в 1996 г, в эксперименте на мышах учеными США было показано, что в культуре кистозно-измененных клеток тубулярного эпителия активизируются синтез и секреция ММП-2, -3, -9 и их ингибиторов ТИМП-1 и -2 [31]. Позже на мышиной модели исследователи показали, что in vivo в срезах почечной ткани также активность ММП-2 и -9 выше, чем у здоровых с выраженным преобладанием ММП-2, причем максимальные значения ММП-2 определялись на 2–3-й неделе жизни мышей, когда почки претерпевают быстрое кистозное увеличение. При зимографии в почках отмечены особенности локализации ММП-2 между кистами, в связи с этим высказано предположение, что ММП-2 могут регулировать накопление коллагена в этих местах [32].

Кроме того, Shchaefer и соавт (1996) провели исследование с целью изучения потенциальной роли ММП-2 и его ингибиторов – ТИМП-1 и -2 – в накоплении компонентов экстрацеллюлярного матрикса при поликистозной болезни почек. В качестве модели были использованы двухмесячные гетерозиготные крысы с ПКБ, которые находились на ранней стадии образования кист. В канальцах активность ММП-2 у них была ниже, чем у здоровых, а активность ТИМП-1 и -2, наоборот, выше по сравнению с контролем. При этом у гомозиготных крыс активность ММП-2 в кистозной жидкости была повышена. Эти результаты свидетельствуют, что активность ММП-2 при ПКБ регулируется активностью ТИМП-1 и -2, а также секрецией ферментов в просвет кисты. Все это ведет к накоплению ЭЦМ, что играет роль в прогрессировании заболевания [33]. В 2005 г. японские ученые подтвердили эти результаты, выявив высокие уровни данных металлопротеиназ в крови больных с АДПКБ [34].

Сравнительное изучение активности ММП-2 и -9 в кистозной жидкости больных с доброкачественными и злокачественными кистозами показало, что активизация ММП происходит в обоих случаях, однако при кистах, связанных с карциномой, концентрация обеих ММП была значительно выше, что отражает биологическую агрессивность кистозной жидкости при злокачественных кистозах [35].

Сравнительное исследование активности ММП в сыворотке крови здоровых людей и больных АДПКБ выявили кроме повышения ММП-9 и ТИМП-1 высокую концентрацию ММП-1 и коллагена IV типа, что ведет к изменению ЭЦМ и способствует формированию и увеличению кист [36].

Изучение структуры строения и особенностей функционирования ММП послужило предпосылкой к созданию синтетических ингибиторов ММП. Это направление в настоящее время активно развивается и представляется перспективным в лечении заболеваний почек, характеризующихся высокой активностью ММП.

В литературе имеются экспериментальные работы, касающиеся терапии поликистоза почек ингибиторами матриксных металлопротеиназ. В исследовании на крысах показано, что повышенная экспрессия коллагена I типа и активность ММП при поликистозной болезни почек могут вызывать формирование новых кист и рост уже имеющихся. Ингибирование активности ММП доксициклином, который в настоящее время считается ингибитором всех ММП, резко замедляет рост кист при ПКБ. Более того, лечение крыс доксициклином значительно сокращало пролиферацию тубулярного эпителия и замедляло прогрессирование заболевания [37].

В отличие от этого при нефронофтизе III типа, который также относится к генетически детерминированным кистозным заболеваниям почек, на мышиной модели не получено подобного эффекта при использовании доксициклина. Более того, в этом случае исследователи отмечали ускорение роста почечных кист и развитие почечного фиброза, что, по их мнению, может быть связано с другими механизмами действия доксициклина [38].

В настоящее время обсуждается роль терапии сиролимусом в регуляции экспрессии ММП в крысиной модели АДПКБ. В ходе исследования выявлено значительное повышение активности ММП-2 и -14 в кистозных эпителиальных клетках крыс с АДПКБ при неизмененном ТИМП-2. На фоне лечения сиролимусом в течение 3 месяцев у крыс, гетерозиготных по АДПКБ, отмечено снижение экспрессии ММП-2 и -14, в то время как у здоровых крыс уровни ММП не менялись по сравнению с исходными. Таким образом, терапия сиролимусом снижает экспрессию ММП-2 и -14, что коррелирует с уменьшением тубулярных изменений и менее агрессивным течением заболевания [39].

Немецкие ученые показали, что использование синтетического ингибитора матриксных металлопротеиназ Batimastat в течение 8 недель у крыс с индуцированным аутосомно-доминантным поликистозом почек привело к значительному уменьшению кист и массы почки, и они считают, что ингибиторы металлопротеиназ представляют собой новое терапевтическое средство против поликистоза почек, которое может применяться независимо от фонового заболевания [40].

Таким образом, многочисленные результаты экспериментальных и клинических исследований свидетельствуют о важной роли ММП и их ингибиторов не только в ключевых процессах клеточной биологии, таких как пролиферация, морфогенез, но и в механизмах прогрессирования нефропатий, в т. ч. и генетически обусловленных. С одной стороны, проявляя хемотаксические свойства, модулируя процессы апоптоза и клеточной пролиферации, ММП/ТИМП принимают участие в воспалительных реакциях. С другой стороны, регулируя активность протеолиза, ММП/ТИМП участвуют в ремоделировании ЭЦМ и базальных мембран.