Proteomic spectrum of the urine in patients with chronic glomerulonephritis


Gassanov M.Z., Batiushin M.M., Terent’ev V.P., Sadovnichaya N.A.

Department of internal diseases #1 at State Budgetary Education Institution of High Professional Education Rostov State Medical University” Ministry of Health and Social Development of Russia
Aim. Search for proteomic molecular markers of development and progression of chronic glomerulonephritis.
Methods. 30 patients (mean age 37,2±1,3 years) with chronic glomerulonephritis were included into the study. Beyond standard clinical and laboratory parameters, molecular phenotype of the urine by methods of proteomics.
Results. Clinical and laboratory signs of chronic glomerulonephritis were registered. Functional groups of new urinary proteins, involved in develohment of anemia, inflammatory process, hypoxia and angiogenesis in renal parenchyma.
Conclusion. Proteomic analysis of the urine revealed 8 groups of proteins, which can serve as predictive markers in chronic glomerulonephritis.

Введение

В настоящее время распространенность хронической болезни почек составляет около 11 % [1, 2, 10], неуклонно возрастает и связанная с ней смертность. По данным Всемирной орга­низации здравоохранения, патология почек и мочевых путей ежегодно приводит к смерти примерно 1 млн человек из 30-35 млн лиц, умирающих от всех хронических заболеваний [1, 2]. Гломерулонефрит составляет 10-15 % гломерулярных забо­леваний почек: для 10-20 % больных причиной заболевания является острый гломерулонефрит; для 80-90 % заболевание до определенного периода протекает латентно, а изменения мочи выявляют случайно [5, 7].

Хронический гломерулонефрит (ХГН) является, согласно регистру ERA-EDTA, причиной 14 % случаев хронической почечной недостаточности (ХПН) в странах Европы [6]. Заболеваемость первичным ХГН составляет 13-50 случаев на 10 тыс. населения. Для вторичного ХГН заболеваемость зависит от распространенности основного заболевания. Первичный ХГН наблюдают в 2 раза чаще среди мужчин, чем среди жен­щин, вторичный - в зависимости от основного заболевания (волчаночный нефрит, узелковый периартериит). ХГН может развиваться в любом возрасте, наиболее часто у детей 3-7 лет и взрослых в возрасте 20-40 лет [6]. Смертность при ХГН зависит от формы и темпов прогрессирования заболевания в ХПН.

Гломерулонефрит — группа заболеваний, характеризующихся воспалительными изменениями, преимущественно в клубоч­ках почек, и связанными с ними клиническими признаками: протеинурией, гематурией, нередко ретенцией натрия и воды, отеками, АГ, снижением функции почек. Страдают также канальцы, в которых развивается воспалительный процесс и некроз с образованием рубцовой ткани [3]. Спорадические случаи постстрептококкового гломерулонефрита по-прежнему наблюдаются, однако в целом распространенность его снизи­лась, что связано с улучшением качества медицинской помощи и социально-экономических условий [1-3].

За последние два десятилетия накопление новых знаний, усовершенствование методов диагностики и лечения способ­ствовали эволюционным изменениям представлений о моле­кулярном патогенезе ХГН, который доказательно раскрывает пути формирования основных гистологических типов ХГН [1-3]. Исследования молекулярных механизмов развития ХГН связаны с открытиями в области генома и протеома человека, освоением нового оборудования, позволяющего выявлять биомаркеры патогенеза ХГН [4, 9].

Целью настоящей работы явился поиск перспективных прогностических молекулярных маркеров возникновения и развития ХГН на основе анализа результатов стандартных методов исследования и протеомных исследований мочи как одного из больших интерактомов в организме человека.

Материал и методы

В клиническое исследование были включены 30 больных ХГН (мужчин - 18, женщин - 12), средний возраст - 37,2 ± 1,3 года. Верифицированы клинические формы заболевания пациентов: латентная форма (16 человек), гипертоническая форма (6 человек), нефротическая форма (6 человек), гематурическая (2 человека). Подтверждены функциональные стадии ХГН: сохранной функции почек (22 человека), с нарушением функции почек и развитием ХПН (8 человек). Контрольную группу составили 30 относительно здоровых лиц в возрасте от 22 до 39 лет. Все пациенты получали симптоматическое лечение при обнаружении отечного синдрома или АГ (антибиотики, цитостатики, глюкокортикоиды, диуретики, антигипертензивные и гиполипидемические препараты, антиагреганты). Критерии включения в исследование: наличие верифици­рованного диагноза хронического гломерулонефрита, забор биообразца (мочи) для масс-спектрометрии до начала терапии глюкокортикостероидами, письменное согласие пациента на проведение исследования.

В исследовании оценивались следующие стандартные показатели: а) клинические параметры - наличие симпто­мов отечного синдрома и артериальной гипертонии (АГ); б) показатели инструментальных методов исследования - УЗИ почек (SonoAceR3, Samsung Medison, Южная Корея), ЭКГ (ScMfe AG, Германия); осмотр глазного дна; в) показатели лабораторных методов исследования - общий анализ крови (анализатор Sysmex XT 2000i, Япония; ALIFAX TEST-1, Италия); биохимический анализ крови (мочевина, креатинин, общий белок, альбумин-глобулиновый коэффициент, общий холестерин, калий и натрий на анализаторе Olympus AU640, (Beckman Coute Inc., США); общий анализ мочи, анализ мочи по Нечипоренко, суточная протеинурия (анализаторы ARCREY Aution MAX, Япония; IRIS IQ-200, США; Sysmex UF-500i, Япония); определение скорости клубочковой фильтрации (СКФ) по формуле Кокрофта-Голда; коагулограмма (анали­заторы ACL 9000 и ACL Elite Рго компании Instmmentation Laboratory, США); иммунологические показатели (компоненты комплемента С3 и С4); антитела к антистрептолизину О, титр антител к двуспиральной ДНК, цитоплазме нейтрофилов, LE (lupus erythematosus)-клеток на анализаторе Access 2 (Beckman Conte Inc., США); г) показатели иммуно-морфологического исследования на материале пункционных биоптатов почек; исследование гистологических препаратов, окрашенных гема­токсилином и эозином по Ван-Гизону и Шифф-реактивом, в цифровом микроскопе (Nikon, Япония); ультраструктурное исследование почек выполнено с помощью трансмиссионного электронного микроскопа JEM-1000 (TOKYO BOEKI Ltd., Япония); иммуноморфологическое исследование почечных биоптатов осуществлено с применением меченых FITC - анти­тел кролика к Ig G, М, А, С3 и фибрину на люминесцентном микроскопе Laboriux S (Leica, Германия); оценка степени фик­сации иммуноглобулинов и комплемента в срезах осуществлена полуколичественным методом по градации интенсивности свечения и распространения в тканях.

Молекулярное фенотипирование мочи пациентов с ХГН выполнено на основе протеомных методов исследования - префракционирование/двумерный электрофорез в поли­акриламидном геле/MALDI (ионизация лазерной десорб­ции при содействии матрицы)-TOF (время-пролетная) - масс-спектрометрия (прибор Ulttaflex II, "Bruker", США). Биоинформационный анализ межмолекулярных взаимо­действий проводился на основе интегрированных баз данных Integra, Entrez, SWISS-PROT, OWL, NRDB, PROSITE, PRINTS, PDB. Обязательным условием включения белка-маркера в диагностический профиль являлся показатель “покрытия сиквенса” при анализе масс-спектрограмм, который составил более 15 %. Кроме того, учитывался показатель “ожидаемой интенсивности пептидного фингерпринта” (“Expect”) для каждого обнаруженного белка, представленный в поисковой системе Mascot Search (UK). Статистическая обработка мате­риала исследования реализована с использованием пакета статистических программ для биомедицинских исследований Statistica 7.0. Различия считались статистически значимыми при р <0,05.

Результаты

В ходе исследования у всех пациентов исследуемой груп­пы зарегистрированы клинико-лабораторные признаки ХГН: наличие мочевого синдрома, АГ, анемии, увеличения содержания мочевины и креатинина в крови, гипоальбуминемии, гипопротеинемии, гиперхолестеринемии, гипер­коагуляции, гипергидратации, протеинурии, микро- или макрогематурии, лимфоцитурии, цилиндрурии, снижения СКФ (табл. 1). Нами не обнаружены антитела к антистрептолизину О, двуспиральной ДНК, цитоплазме нейтрофилов и LE-клеток.

Таблица 1.Показатели стандартных лабораторных исследований у пациентов с хроническим гломерулонефритом.

' Недостоверные различия: * р<0,05; ** р<0,01; *** р < 0,001.

Характерные гистологические изменения обнаружены при нефробиопсии в группе пациентов с ХГН: IgA-нефропатия (n = 12); мембрано-пролиферативный гломерулонефрит (МПГН, n = 7), фокально-сегментарный гломерулосклероз (ФСГС, n = 5), болезнь минимальных изменений (липоидный нефроз) (ЛН, n = 4), мембранозный гломерулонефрит (МГН, n = 2). УЗИ позволило провести дифференциальную диагно­стику ХГН и пиелонефрита.

Молекулярные технологии анализа мочи пациентов с ХГН позволили зарегистрировать и выполнить анализ спектра бел­ков-маркеров с различной Mr. Примеры масс-спектрограмм пептидных фрагментов белков мочи пациента с ХГН и здорового человека представлены на рис. 1 и 2. На масс-спектрограммах прослеживаются различия по показателю m/z пептидных фрагментов белков мочи в диапазоне Mr - от 1 до 14 кДа.

Рисунок 1.Пример масс-спектрограммы пептидных фрагментов и белков мочи здорового человека Н. 52 лет (диапазон Mr = 1 кДа-4 к Да).

Рисунок 2.Пример масс-спектрограммы пептидных фрагментов и белков мочи пациента Б. 35 лет. Хронический гломерулонефрит (морфологический вариант - IgA-нефропатия), гематурическая форма в ст. клинико-лабораторной ремиссии. ХПН 0 ст. (диапазон Мг = 1 кДа-4 кДа).

Обнаружены различия в качественном составе спектра белков мочи и абсолютном количестве здоровых лиц и пациентов с ХГН, у которых представлена экспрессия белков мочи разных функциональных групп (табл. 2).

Таблица 2. Профиль белков-маркеров хронического гломерулонефрита в моче у пациентов.

Примечание. Δ% - прирост количества пациентов с наличием высокой экспрессии белка - маркера поражения почек в моче пациентов с ХГН; Δ% * - прирост числа пациентов с наличием высокой экспрессии белка - маркера поражения почек в моче пациентов с ХГН/контрольная группа здоровых лиц.

Обсуждение

В ходе протеомного анализа нами было выделено более 500 белков. Часть из них удалось классифицировать на функцио­нальные группы, составившие молекулярные профили мочи пациентов с ХГН: 1. Белок, регулирующий процессы свобод­норадикального окисления в нефроците, участник систем детоксикации и элиминации (глицин-амидинотрансфераза); 2. Белки - участники метаболизма в нефроцитах (амидинотрансфераза, агматиназа, лактатдегидрогеназа А, пируват-киназа, мышечная форма); 3. Белки, регулирующие клеточный рост, реакции протеолиза в клетке, процессинг нейрогормональных факторов, процессы ангиогенеза и адгезии клеток (толлоидоподобный белок 2, эритропоэтин, глутатион-S-трансфераза); 4. Белки, регулирующие активность рецепторных структур нефроцитов, сосудов почек (рецептор к эпидермальному фактору роста); 5. Структурные белки почечной ткани (уромодуллин); 6. Транскрипционные факторы, регулирующие активность ядра клетки (метил-CpG-связывающий белок 2, изоформа В); 7. Иммунные белки почечной ткани и белки - участники иммунновоспалительных процессов (комплемент C4B, пероксиредоксин 1, β-дефензин-1); 8. Транспортные белки (трансферрин, РСБ).

Каждая молекула белка в функциональной группе взаи­модействует с другими молекулами белков, реализуя межмолекулярные взаимодействия. В качестве примера на рис. 3 представлены межмолекулярные взаимодействия эритропоэтина, объясняющие механизмы развития анемии, иммуновоспалительного процесса, гипоксии и ангиогенеза в почечной паренхиме, которые являются основой клинического фенотипа ХГН. Так, плотность рецепторов к эритропоэтину при ХГН значительно уменьшается, что приводит к развитию анемии. Эритропоэтин также взаимодействует с белками GATA1 и GATA2, которые совместно стимулируют синтез гемоглобина и дифференцировку эритроцитов. Уменьшение передачи сигнала от эритропоэтина к транскрипционным факторам GATA1 и GATA2 при ХГН также является важным патогенетическим обоснованием развития анемии.

Рисунок 3. Схема межмолекулярных взаимодействий эритропоэтина.

При идентификации белковых молекул в моче пациентов различных морфологических вариантов ХГН у пациентов с IgA-нефропатией выявлены рецепторы VI почечных канальцев к вазопрессину, ответственные за регуляцию артериального давления, повышенный риск развития несахарного диабета и артериальной гипертензии; был также обнаружен белок Tolloid-like-2 (TILL2), обладающий металлопротеазной активностью, приводящей к вазоконстрикции, являющийся фактором риска развития АГ [11]. Белок TILL2 был найден и в биообразцах пациентов с МПГН и МГН. На масс-спектрограмме 5 пациентов (3 - с ЛН и 2 - с МПГН) с высокой достоверностью определен антионкоген - TACC1 (Transforming, acidic coiled-coil containing protein 2), повышенное содержание его в моче является фак­тором риска развития онкопатологии [8, 9]. В биообразцах встречались и другие онкогены, свидетельствующие о высоком риске онкопатологии. Наличие клинической симптоматики, соответствующей паранеопластическим проявлениям, тяжелое течение и рефрактерность к патогенетической терапии дикто­вали необходимость проведения дальнейшего обследования, направленного на онкопоиск.

Идентифицированы и более редкие протеомы, характерные для пациентов с МГН и МПГН. Так, найден Integrin alpha-7, который указывает на повышенный риск развития рака или повышенный риск рецидива рака, в частности, предстательной железы, глиобластомы мультиформной, леймиосаркомы или гепатоцеллюлярной карциномы. У пациента с IgA-нефропатией выявлен достоверно высокий уровень Profilin II, отражающего работу мембран клеток и являющегося регулятором мембран­ного поглощения. Гиперэкспрессия profilin II в клетках пре­пятствует поглощению мембран. Нужно отметить, что profilin II также участвует в перестройке актинового цитоскелета и имеет большое значение для таких процессов, как развитие органа, заживление ран [8, 11]. Filamin A, обнаруженный у пациентов с МПГН, также принимает участие в построении цитоскелета и процессах, регулирующих ангиогенез и тромбообразование [4, 8, 9, 11].

У части пациентов (МГН, n = 2, и МПГН, n = 4) с высокой достоверностью определен белок β-дефензин-1, относящийся к семейству дефензинов. Он обладает бактерицидной и цитотоксической активностью, вырабатывается нейтрофилами. Повышенная экспрессия β-дефензина-1 у части пациентов с ХГН свидетельствует о наличии положительного прогноза течения заболевания в связи с блокадой этим белком активации иммуновоспалительного процесса в ткани почек. Снижение экспрессии β-дефензина-1 у оставшейся части пациентов позволяет верифицировать ХГН как быстропрогрессирующий вариант течения заболевания. У пациентов с ХГН увеличение экспрессии β-дефензина-1 может сопровождаться повышенной экспрессией белка CCR6, который в свою очередь способствует формированию нодулярных воспалительных инфильтратов в почечной ткани.

Заключение

В проведенном нами исследовании выявлены протеины, ответственные за процессы воспаления, иммунного ответа, характерные для разных фаз течения патологического процесса. Для каждой формы ХГН характерно специфическое протеомное зеркало. Определяемые маркеры - мочевые факторы риска - позволят совершенствовать представления о патогенезе хро­нических гломерулопатий и прогнозировать эффективность терапии, исход заболевания и темпы прогрессирования ХПН.

С расшифровкой масс-спектрограмм мочи пациентов с ХГН удалось выделить группы молекул белков, которые могут являться потенциальными чувствительными и специ­фическими маркерами возникновения и прогрессирования заболевания.

Анализ межмолекулярных взаимодействий иммунных белков почечной ткани и белков - участников иммунновоспалитель­ных процессов позволяет обнаруживать потенциальные маркеры, которые могут как определять положительную динамику в развитии аутоиммунного процесса, так и характеризовать его прогрессирование.

Среди полученных белков были найдены протеомы, которые еще предстоит идентифицировать и выяснить их место и роль в формировании патологического процесса.


About the Autors


Batushin M.M. – Vice-rector on Scientific-Research division, professor at department of internal diseases #1 at State Budgetary Education Institution of High Professional Education Rostov State Medical University ” Ministry of Health and Social Development of Russia, Ph.D.
Gassanov M.Z. – assistant at department of internal diseases #1 at State Budgetary Education Institution of High Professional Education Rostov State Medical University ” Ministry of Health and Social Development of Russia
E-mail: mitkhat@mail.ru;
Terentiev V.P. – vice-rector on medical division, professor, head of department of internal diseases #1 at State Budgetary Education Institution of High Professional Education Rostov State Medical University Рост ГМУ ” Ministry of Health and Social Development of Russia, Ph.D.
Sadovnichaya N.A. – nephrologist at Nephrology Department at Rostov State Medical University Clinic.


Similar Articles


Бионика Медиа