English
Введение
В настоящее время распространенность хронической болезни почек составляет около 11 % [1, 2, 10], неуклонно возрастает и связанная с ней смертность. По данным Всемирной организации здравоохранения, патология почек и мочевых путей ежегодно приводит к смерти примерно 1 млн человек из 30-35 млн лиц, умирающих от всех хронических заболеваний [1, 2]. Гломерулонефрит составляет 10-15 % гломерулярных заболеваний почек: для 10-20 % больных причиной заболевания является острый гломерулонефрит; для 80-90 % заболевание до определенного периода протекает латентно, а изменения мочи выявляют случайно [5, 7].
Хронический гломерулонефрит (ХГН) является, согласно регистру ERA-EDTA, причиной 14 % случаев хронической почечной недостаточности (ХПН) в странах Европы [6]. Заболеваемость первичным ХГН составляет 13-50 случаев на 10 тыс. населения. Для вторичного ХГН заболеваемость зависит от распространенности основного заболевания. Первичный ХГН наблюдают в 2 раза чаще среди мужчин, чем среди женщин, вторичный - в зависимости от основного заболевания (волчаночный нефрит, узелковый периартериит). ХГН может развиваться в любом возрасте, наиболее часто у детей 3-7 лет и взрослых в возрасте 20-40 лет [6]. Смертность при ХГН зависит от формы и темпов прогрессирования заболевания в ХПН.
Гломерулонефрит — группа заболеваний, характеризующихся воспалительными изменениями, преимущественно в клубочках почек, и связанными с ними клиническими признаками: протеинурией, гематурией, нередко ретенцией натрия и воды, отеками, АГ, снижением функции почек. Страдают также канальцы, в которых развивается воспалительный процесс и некроз с образованием рубцовой ткани [3]. Спорадические случаи постстрептококкового гломерулонефрита по-прежнему наблюдаются, однако в целом распространенность его снизилась, что связано с улучшением качества медицинской помощи и социально-экономических условий [1-3].
За последние два десятилетия накопление новых знаний, усовершенствование методов диагностики и лечения способствовали эволюционным изменениям представлений о молекулярном патогенезе ХГН, который доказательно раскрывает пути формирования основных гистологических типов ХГН [1-3]. Исследования молекулярных механизмов развития ХГН связаны с открытиями в области генома и протеома человека, освоением нового оборудования, позволяющего выявлять биомаркеры патогенеза ХГН [4, 9].
Целью настоящей работы явился поиск перспективных прогностических молекулярных маркеров возникновения и развития ХГН на основе анализа результатов стандартных методов исследования и протеомных исследований мочи как одного из больших интерактомов в организме человека.
Материал и методы
В клиническое исследование были включены 30 больных ХГН (мужчин - 18, женщин - 12), средний возраст - 37,2 ± 1,3 года. Верифицированы клинические формы заболевания пациентов: латентная форма (16 человек), гипертоническая форма (6 человек), нефротическая форма (6 человек), гематурическая (2 человека). Подтверждены функциональные стадии ХГН: сохранной функции почек (22 человека), с нарушением функции почек и развитием ХПН (8 человек). Контрольную группу составили 30 относительно здоровых лиц в возрасте от 22 до 39 лет. Все пациенты получали симптоматическое лечение при обнаружении отечного синдрома или АГ (антибиотики, цитостатики, глюкокортикоиды, диуретики, антигипертензивные и гиполипидемические препараты, антиагреганты). Критерии включения в исследование: наличие верифицированного диагноза хронического гломерулонефрита, забор биообразца (мочи) для масс-спектрометрии до начала терапии глюкокортикостероидами, письменное согласие пациента на проведение исследования.
В исследовании оценивались следующие стандартные показатели: а) клинические параметры - наличие симптомов отечного синдрома и артериальной гипертонии (АГ); б) показатели инструментальных методов исследования - УЗИ почек (SonoAceR3, Samsung Medison, Южная Корея), ЭКГ (ScMfe AG, Германия); осмотр глазного дна; в) показатели лабораторных методов исследования - общий анализ крови (анализатор Sysmex XT 2000i, Япония; ALIFAX TEST-1, Италия); биохимический анализ крови (мочевина, креатинин, общий белок, альбумин-глобулиновый коэффициент, общий холестерин, калий и натрий на анализаторе Olympus AU640, (Beckman Coute Inc., США); общий анализ мочи, анализ мочи по Нечипоренко, суточная протеинурия (анализаторы ARCREY Aution MAX, Япония; IRIS IQ-200, США; Sysmex UF-500i, Япония); определение скорости клубочковой фильтрации (СКФ) по формуле Кокрофта-Голда; коагулограмма (анализаторы ACL 9000 и ACL Elite Рго компании Instmmentation Laboratory, США); иммунологические показатели (компоненты комплемента С3 и С4); антитела к антистрептолизину О, титр антител к двуспиральной ДНК, цитоплазме нейтрофилов, LE (lupus erythematosus)-клеток на анализаторе Access 2 (Beckman Conte Inc., США); г) показатели иммуно-морфологического исследования на материале пункционных биоптатов почек; исследование гистологических препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином по Ван-Гизону и Шифф-реактивом, в цифровом микроскопе (Nikon, Япония); ультраструктурное исследование почек выполнено с помощью трансмиссионного электронного микроскопа JEM-1000 (TOKYO BOEKI Ltd., Япония); иммуноморфологическое исследование почечных биоптатов осуществлено с применением меченых FITC - антител кролика к Ig G, М, А, С3 и фибрину на люминесцентном микроскопе Laboriux S (Leica, Германия); оценка степени фиксации иммуноглобулинов и комплемента в срезах осуществлена полуколичественным методом по градации интенсивности свечения и распространения в тканях.
Молекулярное фенотипирование мочи пациентов с ХГН выполнено на основе протеомных методов исследования - префракционирование/двумерный электрофорез в полиакриламидном геле/MALDI (ионизация лазерной десорбции при содействии матрицы)-TOF (время-пролетная) - масс-спектрометрия (прибор Ulttaflex II, "Bruker", США). Биоинформационный анализ межмолекулярных взаимодействий проводился на основе интегрированных баз данных Integra, Entrez, SWISS-PROT, OWL, NRDB, PROSITE, PRINTS, PDB. Обязательным условием включения белка-маркера в диагностический профиль являлся показатель “покрытия сиквенса” при анализе масс-спектрограмм, который составил более 15 %. Кроме того, учитывался показатель “ожидаемой интенсивности пептидного фингерпринта” (“Expect”) для каждого обнаруженного белка, представленный в поисковой системе Mascot Search (UK). Статистическая обработка материала исследования реализована с использованием пакета статистических программ для биомедицинских исследований Statistica 7.0. Различия считались статистически значимыми при р <0,05.
Результаты
В ходе исследования у всех пациентов исследуемой группы зарегистрированы клинико-лабораторные признаки ХГН: наличие мочевого синдрома, АГ, анемии, увеличения содержания мочевины и креатинина в крови, гипоальбуминемии, гипопротеинемии, гиперхолестеринемии, гиперкоагуляции, гипергидратации, протеинурии, микро- или макрогематурии, лимфоцитурии, цилиндрурии, снижения СКФ (табл. 1). Нами не обнаружены антитела к антистрептолизину О, двуспиральной ДНК, цитоплазме нейтрофилов и LE-клеток.
Таблица 1.Показатели стандартных лабораторных исследований у пациентов с хроническим гломерулонефритом.
' Недостоверные различия: * р<0,05; ** р<0,01; *** р < 0,001.
Характерные гистологические изменения обнаружены при нефробиопсии в группе пациентов с ХГН: IgA-нефропатия (n = 12); мембрано-пролиферативный гломерулонефрит (МПГН, n = 7), фокально-сегментарный гломерулосклероз (ФСГС, n = 5), болезнь минимальных изменений (липоидный нефроз) (ЛН, n = 4), мембранозный гломерулонефрит (МГН, n = 2). УЗИ позволило провести дифференциальную диагностику ХГН и пиелонефрита.
Молекулярные технологии анализа мочи пациентов с ХГН позволили зарегистрировать и выполнить анализ спектра белков-маркеров с различной Mr. Примеры масс-спектрограмм пептидных фрагментов белков мочи пациента с ХГН и здорового человека представлены на рис. 1 и 2. На масс-спектрограммах прослеживаются различия по показателю m/z пептидных фрагментов белков мочи в диапазоне Mr - от 1 до 14 кДа.
Рисунок 1.Пример масс-спектрограммы пептидных фрагментов и белков мочи здорового человека Н. 52 лет (диапазон Mr = 1 кДа-4 к Да).
Рисунок 2.Пример масс-спектрограммы пептидных фрагментов и белков мочи пациента Б. 35 лет. Хронический гломерулонефрит (морфологический вариант - IgA-нефропатия), гематурическая форма в ст. клинико-лабораторной ремиссии. ХПН 0 ст. (диапазон Мг = 1 кДа-4 кДа).
Обнаружены различия в качественном составе спектра белков мочи и абсолютном количестве здоровых лиц и пациентов с ХГН, у которых представлена экспрессия белков мочи разных функциональных групп (табл. 2).
Таблица 2. Профиль белков-маркеров хронического гломерулонефрита в моче у пациентов.
Примечание. Δ% - прирост количества пациентов с наличием высокой экспрессии белка - маркера поражения почек в моче пациентов с ХГН; Δ% * - прирост числа пациентов с наличием высокой экспрессии белка - маркера поражения почек в моче пациентов с ХГН/контрольная группа здоровых лиц.
Обсуждение
В ходе протеомного анализа нами было выделено более 500 белков. Часть из них удалось классифицировать на функциональные группы, составившие молекулярные профили мочи пациентов с ХГН: 1. Белок, регулирующий процессы свободнорадикального окисления в нефроците, участник систем детоксикации и элиминации (глицин-амидинотрансфераза); 2. Белки - участники метаболизма в нефроцитах (амидинотрансфераза, агматиназа, лактатдегидрогеназа А, пируват-киназа, мышечная форма); 3. Белки, регулирующие клеточный рост, реакции протеолиза в клетке, процессинг нейрогормональных факторов, процессы ангиогенеза и адгезии клеток (толлоидоподобный белок 2, эритропоэтин, глутатион-S-трансфераза); 4. Белки, регулирующие активность рецепторных структур нефроцитов, сосудов почек (рецептор к эпидермальному фактору роста); 5. Структурные белки почечной ткани (уромодуллин); 6. Транскрипционные факторы, регулирующие активность ядра клетки (метил-CpG-связывающий белок 2, изоформа В); 7. Иммунные белки почечной ткани и белки - участники иммунновоспалительных процессов (комплемент C4B, пероксиредоксин 1, β-дефензин-1); 8. Транспортные белки (трансферрин, РСБ).
Каждая молекула белка в функциональной группе взаимодействует с другими молекулами белков, реализуя межмолекулярные взаимодействия. В качестве примера на рис. 3 представлены межмолекулярные взаимодействия эритропоэтина, объясняющие механизмы развития анемии, иммуновоспалительного процесса, гипоксии и ангиогенеза в почечной паренхиме, которые являются основой клинического фенотипа ХГН. Так, плотность рецепторов к эритропоэтину при ХГН значительно уменьшается, что приводит к развитию анемии. Эритропоэтин также взаимодействует с белками GATA1 и GATA2, которые совместно стимулируют синтез гемоглобина и дифференцировку эритроцитов. Уменьшение передачи сигнала от эритропоэтина к транскрипционным факторам GATA1 и GATA2 при ХГН также является важным патогенетическим обоснованием развития анемии.
Рисунок 3. Схема межмолекулярных взаимодействий эритропоэтина.
При идентификации белковых молекул в моче пациентов различных морфологических вариантов ХГН у пациентов с IgA-нефропатией выявлены рецепторы VI почечных канальцев к вазопрессину, ответственные за регуляцию артериального давления, повышенный риск развития несахарного диабета и артериальной гипертензии; был также обнаружен белок Tolloid-like-2 (TILL2), обладающий металлопротеазной активностью, приводящей к вазоконстрикции, являющийся фактором риска развития АГ [11]. Белок TILL2 был найден и в биообразцах пациентов с МПГН и МГН. На масс-спектрограмме 5 пациентов (3 - с ЛН и 2 - с МПГН) с высокой достоверностью определен антионкоген - TACC1 (Transforming, acidic coiled-coil containing protein 2), повышенное содержание его в моче является фактором риска развития онкопатологии [8, 9]. В биообразцах встречались и другие онкогены, свидетельствующие о высоком риске онкопатологии. Наличие клинической симптоматики, соответствующей паранеопластическим проявлениям, тяжелое течение и рефрактерность к патогенетической терапии диктовали необходимость проведения дальнейшего обследования, направленного на онкопоиск.
Идентифицированы и более редкие протеомы, характерные для пациентов с МГН и МПГН. Так, найден Integrin alpha-7, который указывает на повышенный риск развития рака или повышенный риск рецидива рака, в частности, предстательной железы, глиобластомы мультиформной, леймиосаркомы или гепатоцеллюлярной карциномы. У пациента с IgA-нефропатией выявлен достоверно высокий уровень Profilin II, отражающего работу мембран клеток и являющегося регулятором мембранного поглощения. Гиперэкспрессия profilin II в клетках препятствует поглощению мембран. Нужно отметить, что profilin II также участвует в перестройке актинового цитоскелета и имеет большое значение для таких процессов, как развитие органа, заживление ран [8, 11]. Filamin A, обнаруженный у пациентов с МПГН, также принимает участие в построении цитоскелета и процессах, регулирующих ангиогенез и тромбообразование [4, 8, 9, 11].
У части пациентов (МГН, n = 2, и МПГН, n = 4) с высокой достоверностью определен белок β-дефензин-1, относящийся к семейству дефензинов. Он обладает бактерицидной и цитотоксической активностью, вырабатывается нейтрофилами. Повышенная экспрессия β-дефензина-1 у части пациентов с ХГН свидетельствует о наличии положительного прогноза течения заболевания в связи с блокадой этим белком активации иммуновоспалительного процесса в ткани почек. Снижение экспрессии β-дефензина-1 у оставшейся части пациентов позволяет верифицировать ХГН как быстропрогрессирующий вариант течения заболевания. У пациентов с ХГН увеличение экспрессии β-дефензина-1 может сопровождаться повышенной экспрессией белка CCR6, который в свою очередь способствует формированию нодулярных воспалительных инфильтратов в почечной ткани.
Заключение
В проведенном нами исследовании выявлены протеины, ответственные за процессы воспаления, иммунного ответа, характерные для разных фаз течения патологического процесса. Для каждой формы ХГН характерно специфическое протеомное зеркало. Определяемые маркеры - мочевые факторы риска - позволят совершенствовать представления о патогенезе хронических гломерулопатий и прогнозировать эффективность терапии, исход заболевания и темпы прогрессирования ХПН.
С расшифровкой масс-спектрограмм мочи пациентов с ХГН удалось выделить группы молекул белков, которые могут являться потенциальными чувствительными и специфическими маркерами возникновения и прогрессирования заболевания.
Анализ межмолекулярных взаимодействий иммунных белков почечной ткани и белков - участников иммунновоспалительных процессов позволяет обнаруживать потенциальные маркеры, которые могут как определять положительную динамику в развитии аутоиммунного процесса, так и характеризовать его прогрессирование.
Среди полученных белков были найдены протеомы, которые еще предстоит идентифицировать и выяснить их место и роль в формировании патологического процесса.
