Введение

Трансплантация почки является методом выбора в лечении больных с терминальной стадией хронической почечной недостаточности (ТХПН). Одной из главных причин потери трансплантата является острое отторжение, поэтому своевременная его диагностика и адекватное проведение противокризовой терапии – первоочередные задачи клинициста.

В настоящее время диагностика острой реакции отторжения основывается на комплексной оценке клинических симптомов, лабораторных показателей и результатов специальных инструментальных методов, включая ультразвуковое, допплеровское исследования и динамическую нефросцинтиграфию. Однако большинство определяемых признаков не является строго специфичным для острого отторжения [1, 2]. Они могут регистрироваться в различных комбинациях вследствие острого канальцевого некроза, инфекционных, хирургических осложнений, токсичности ингибиторов кальциневрина и других лекарственных средств [3, 4].

Достоверным методом диагностики острой реакции отторжения является пункционная биопсия, однако и этот метод не лишен недостатков в связи с инвазивностью и возможным развитием ряда осложнений.

Поиск безопасных и информативных методов в оценке контроля посттрансплантационного иммунитета, эффективных в диагностике и контроле лечения криза отторжения является актуальной задачей трансплантологии [4, 5].

Цель настоящей работы заключалась в изучении возможностей интерференционной фазометрии ядерных структур лимфоцитов в доклинической диагностике острого отторжения почечного трансплантата и оценке эффективности противокризовой терапии.

Материал и методы

В исследование были включены 36 больных с ТХПН, которым выполнена трансплантация почки в 2005– 2008 гг. в ГУ МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского. В исследовании участвовали 18 мужчин и 18 женщин в возрасте от 20 до 59 лет (средний возраст – 42 ± 9,5 лет). Для определения показателей нормы морфофункционального состояния ядерных структур лимфоцитов были обследованы 30 практически здоровых добровольцев в возрасте от 18 до 59 лет (средний возраст – 36 ± 7,6 года).

Причинами, приведшими к ТХПН, являлись хронический гломерулонефрит – 61 % (n = 22), хронический пиелонефрит – 22,2 % (n = 8), синдром Альпорта – ,6 % (n = 2), подагра – 5,6 % (n = 2), хронический тубулоинтерстициальный нефрит – 5,6 % (n = 2).

Все больные до аллотрансплантации трупной почки (АТТП) получали заместительную почечную терапию − гемо- или перитонеальный диализ. Средний срок нахождения на диализе составил 29,7 ± 18,4 месяца.

Во всех случаях органы были получены от трупных доноров. Среднее время холодовой ишемии донорской почки составило 22,1 ± 2,6 часа.

Степень HLA-совместимости оценена по числу антигенов HLA донора, совпадающих с антигенами HLA реципиента. Уровень предсуществующих антител у реципиента определен в стандартном комплемент-зависимом лимфоцитотоксическом тесте.

В послеоперационном периоде использован следующий протокол иммуносупрессии: Циклоспорин (ЦсА) 2,5 мг/кг массы тела, Селлсепт 1,5–2 г/сут, Преднизолон 0,5 мг/кг. Зенапакс 1 мг/кг массы тела вводился в/в перед операцией, на 14-й, 28-й и 42-й дни, метилпреднизолон – в/в перед включением почки в кровоток, на 2-е и 4-е сутки.

Острое отторжение почечного трансплантата купировали “пульсами” метилпреднизилона до общей дозы 3,0 г. При стероидрезистентных кризах применялся антитимоцитарный глобулин – AТГ (Фрезениус). При остром отторжении сосудистого или смешанного типа в комплексное лечение включали плазмаферез.

Для оценки адекватности получаемой дозы ЦсА всем больным после трансплантации почки определялась концентрация ЦсА в цельной крови иммуноферментным анализатором TDX фирмы “Аbbott”.

МОНИТОРИНГ

Всем пациентам проведены стандартные клинико-лабораторные, рентгенологические, ультразвуковые допплеровские исследования, динамическая нефросцинтиграфия.

Пункционные биоптаты трансплантата получали в стерильных условиях под местной анестезией и ультразвуковым контролем. Пункции осуществлены с помощью аппарата для биопсий GT GUN 22 (Италия). Для гистологического исследования биоптаты фиксировали в 10 %-ном нейтральном растворе формалина, обезвоживали в спиртах нарастающей концентрации и заливали в парафин по общепринятой методике. Срезы толщиной 5–7 мкм исследовали гистологически, гистохимически и иммуногистохимически. Оценка полученных данных проведена по классификации Banff 97.

Метод компьютерной фазовой морфометрии (КФМ) был применен для изучения количественных показателей молекулярной организации интерфазного хроматина ядер лимфоцитов периферической крови на базе отечественного компьютерного лазерного фазово-интерференционного микроскопа Цитоскан (МГИРЭА, Москва) [2].

Больных с ТХПН на этапе лечения перитонеальным диализом и гемодиализом обследовали однократно. Реципиенты почечного аллотрансплантата наблюдались в течение раннего послеоперационного периода (30 суток после АТТП) с осуществлением посуточного мониторинга клинико-лабораторных показателей и выполнением компьютерной фазометрии лимфоцитов периферической крови.

Результаты и обсуждение

В качестве модельной системы in vitro для изучения перехода клеток от состояния покоя к активной пролиферации были выбраны Т-лимфоциты периферической крови, активированные фитогемагглютинином (ФГА). В исследованиях были получены доказательства, что компьютерная фазовая морфометрия (КФМ) позволяет выявлять детальные изменения фазовых параметров лимфоцитов, непосредственно связанные с их активацией. Исследования образцов с интактными лимфоцитами, находящимися в интерфазе, показали, что на их топограммах четко визуализируются цитоплазма, ядро и слабоконтрастное ядрышко (рис. 1).

Для активации лимфоцитов к взвеси клеток in vitro в качестве индуктора активации добавлены ФГА с экспозицией в течение часа при 37 °С. После инкубации проведена компьютерная морфометрия активированных лимфоцитов (рис. 2).

Изучение динамики морфометрических показателей в процессе активации показало, что уже в течение одного часа после добавления ФГА фазовая высота клетки и ее ядра достоверно снижаются практически в 1,5 и более раз (с 220,0 ± 39,0 до 95,0 ± 24,0 нм). Снижение фазовой высоты сопровождается существенными изменениями в морфологии лимфоцита: уменьшается фазовая толщина цитоплазмы, на фоне ядра выделяется контрастное ядрышко, в котором перераспределяется хроматин и появляются множественные фибриллярные центры.

Таким образом, фазовая высота – объективный количественный параметр, отражающий степень активации лимфоцитов и позволяющий регистрировать процесс в самой ранней фазе.

Как Т-, так и В-лимфоциты разделили на четыре группы в зависимости от величины фазовой высоты и, соответственно, с различным уровнем функциональной активности. И каждой группе присвоены коэффициенты активности от 0 до 3.

Следовательно, ядерный полиморфизм циркулирующей популяции лимфоцитов может быть охарактеризован с использованием показателя функциональной активности ядра (FA) как величина, обратно пропорциональная фазовой высоте (PH) каждой клетки в выборке по формуле:

FA = (3*n3+2*n2+1*n1+0.0*n0)/n,

где FA – функциональная активность ядра; n3 – количество клеток с PH ≤ 1,5 мкм; n2 – с PH > 1,5, но ≤ 2 мкм; n1 – с PH > 2, но ≤ 2,5 мкм; n0 – с PH > 2,5; n – число клеток в выборке. Индекс перед количеством клеток означает коэффициент активации клеток с определенной высотой.

Установлено, что у практически здоровых лиц значение FA составило 1,83 ± 0,1 для Т- и 1,85 ± 0,1 для В-лимфоцитов. Полученные высокие показатели связаны с преобладанием лимфоцитов со средним и низким значениями фазовой высоты, т. е. функционально активных клеток.

Значения функциональной активности ядер Т- и В- лимфоцитов больных с ТХПН, находящихся на лечении гемодиализом или перитонеальным диализом, и практически здоровых лиц представлены в таблице.

Как для Т-, так и для В- лимфоцитов больных ТХПН характерно достоверное уменьшение функциональной активности ядер клеток. На основании полученных результатов можно предположить, что в Т- и В-звене иммунитета имеются признаки функциональной недостаточности, связанной, очевидно, с подавлением клеточной активации.

Проанализированы результаты обследования 18 больных в раннем послеоперационном периоде после аллотрансплантации трупной почки с первичной стабильной функцией трансплантата и 12 реципиентов почечного трансплантата с отсроченной функцией трансплантата.

Динамика показателей диуреза и креатинина плазмы у данных групп пациентов представлена на рис. 3 и рис. 4.

Проведенное исследование функциональной ядерной активности Т- и В-лимфоцитов периферической крови методом компьютерной фазовой морфометрии у реципиентов почечного трансплантата с первичной и отсроченной функциями представлено на рис. 5 и рис. 6.

На 4–5-е сутки зарегистрированы наименьшие значения ядерной активности лимфоцитов, что, вероятно, связано с проведением интенсивной иммуносупрессии в эти сроки, а также реакцией организма на оперативное вмешательство. К 8–10-м суткам наблюдаются рост и стабилизация показателя ядерной активности в связи с адаптационными процессами перестройки морфофункционального состояния иммунокомпетентных клеток при реализации реакции трансплантационного иммунитета.

Из представленных данных видно, что у реципиентов почечного трансплантата происходит достоверное уменьшение функциональной активности ядер Т- и В-лимфоцитов, что характеризует степень подавления иммунореактивности пациентов в процессе иммуносупрессии. При этом достоверно значимых различий снижения иммунореактивности при первичной и отсроченной функциях трансплантата (без иммунологического конфликта) не выявлено.

Проанализированы результаты обследования 6 больных, у которых в раннем послеоперационном периоде выявлен криз отторжения трансплантата (рис. 7).

В данной группе у реципиентов почечного трансплантата при наличии острого отторжения по клеточному типу наблюдался подъем ядерной активности Т-лимфоцитов до 1,71 ± 0,05, т. е. на 25,7 % по сравнению с пациентами с неосложненным течением раннего послеоперационного периода. При кризе отторжения по сосудистому типу показатель ядерной активности составил 1,88 ± 0,10, что на 35 % выше, чем в группе с течением послеоперационного периода без иммунологического конфликта.

Острое отторжение почечного трансплантата купировали “пульсами” метилпреднизилона до общей дозы 3,0 г. При стероидрезистентных кризах применялся антитимоцитарный глобулин – AТГ (Фрезениус). При остром отторжении сосудистого или смешанного типа в комплексное лечение включали плазмаферез.

Результаты мониторинга ядерной активности Т- и В-лимфоцитов периферической крови реципиентов ренального трансплантата представлены на рис. 8.

Из представленных данных видно, что на фоне проводимой противокризовой терапии как для Т-, так и для В-лимфоцитов характерно достоверное уменьшение функциональной активности ядер клеток. FA достигает значений, сопоставимых с показателями в группе с неосложненным течением и даже ниже.

Таким образом, показатель функциональной активности ядер Т- и В-лимфоцитов характеризует степень изменения иммунореактивности пациентов в процессе иммуносупрессии при лечении острого отторжения почечного трансплантата.

В экспериментах in vitro установлены дозо- и времязависимые эффекты изменения фазовых показателей ядер лимфоцитов человека, активированных митогеном фитогемагглютинином. Фазовая высота живой клетки отражает особенности ядерного полиморфизма, предшествует динамике других ее морфометрических показателей и может рассматриваться в качестве раннего критерия пролиферативной активности лимфоцита.

Среднепопуляционные показатели функциональной активности ядер (FA) Т- и В-лимфоцитов больных с ТХПН отражают снижение пролиферативного потенциала циркулирующих клеток и составляют 1,56 и 1,54 против 1,83 и 1,85, установленных у здоровых лиц.

В посттрансплантационном периоде у пациентов без криза отторжения отмечается подавление функциональной активности циркулирующих лимфоцитов: величина FA Т- и В-клеток снижается до 1, 21 и 1,35 соответственно как при первичной, так и при отсроченной функции трансплантата.

При развитии острой реакции отторжения трансплантата на фоне базовой иммуносупрессии наблюдается прогрессирующее увеличение функциональной активности лимфоцитов: величина FA составляет ≥ 1,8 ± 0,1.

Эффективность противокризовой терапии может быть количественно оцененной по динамике значений показателя функциональной активности ядер лимфоцитов: снижение FA до 1,4 свидетельствует об эффективности проводимого лечения.