Высокая распространенность в мире хронической болезни почек (ХБП), ассоциированных с ней рисков и осложнений представляет собой серьезную медико-социальную проблему, решение которой является основной задачей современной нефрологии.

В структуре ХБП хронический гломерулонефрит (ХГН) занимает особое место как одна из основных причин терминальной почечной недостаточности [1–3]. Он представляет собой многофакторное полигенное заболевание, в понимании механизмов возникновения и прогрессирования которого за последние десятилетия достигнут значительный прогресс, однако молекулярно-генетические основы, определяющие разнообразие его клинических проявлений, различия в исходах и чувствительности больных к проводимой терапии, окончательно не установлены. Их изучение имеет не только теоретическое, но и большое практическое значение, поскольку создает подходы к разработке персонифицированной тактики лечения больных ХГН.

Роль воспалительного ответа в прогрессировании ХГН является предметом детального изучения, причем особое внимание уделяется процессам, опосредуемым цитокинами – семейством интерлейкинов, факторами некроза опухоли.

В многочисленных исследованиях были уточнены характеристики наиболее значимых про- и противовоспалительных цитокинов и механизмы их действия, приводящие к формированию гломерулярного повреждения и тубулоинтерстициального фиброза [4–11]. Это позволило рассматривать кодирующие их гены в качестве возможных генов-кандидатов, полиморфные маркеры которых могут быть ассоциированы с предрасположенностью к развитию и прогрессированию ХГН и определять особенности его клинического течения.

До настоящего времени опубликованы единичные работы, посвященные изучению ассоциаций полиморфных маркеров генов цитокинов с транскрипционной активностью и уровнем цитокинов, а также клиническими проявлениями заболеваний почек, в т.ч. гломерулонефритов, эффективностью иммуносупрессивной терапии. Так, обнаружена ассоциация полиморфных маркеров C-889T гена интерлейкина-1 (IL-1A) и A-4257G гена интерлейкина-13 (IL13) с уровнем протеинурии [12].

В другой работе генотип АА полиморфного маркера A-4257G гена IL13 был ассоциирован с развитием нефротического синдрома с минимальными изменениями (НСМИ) у детей [13]. Получены данные о влиянии ряда полиморфных маркеров генов провоспалительных цитокинов (интерлейкина-4 [IL4], интерлейкина-6 [IL6] и фактора некроза опухоли-α [TNF]) на чувствительность к иммуносупрессивной терапии при НСМИ у детей [14]. Для полиморфных маркеров С-592С гена интерлейкина-10 (IL10) и VNTR гена антагониста рецептора интерлейкина-1 (IL-1R) была описана ассоциация с клиническими вариантами ХГН [15]. В то же время в ряде работ [16–18] подобные ассоциации отсутствовали, что объясняется, по-видимому, малым числом исследований, различием изучаемых популяций, в т.ч. неоднородностью групп по клиническим и морфологическим формам ХГН.

Целью нашей работы было изучить ассоциацию полиморфных маркеров G(-238)A гена фактора некроза опухоли-α (TNF), G(-174)C гена интерлейкина-6 (IL6) и G(-1082)A гена интерлейкина-10 (IL10) с клинико-морфологическими особенностями хронического гломерулонефрита (ХГН).

Материал и методы

В ретроспективное исследование включили 102 больных ХГН (47 мужчин и 55 женщин), наблюдавшихся в клинике нефрологии, внутренних и профессиональных болезней им. Е.М. Тареева УКБ № 3 ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова». Клинические особенности ХГН оценивали на момент постановки диагноза.

У 56 пациентов диагноз ХГН был подтвержден морфологически. Мезангиопролиферативный ГН выявлен у 17 больных, мезангиокапиллярный – у 5, мембранозная нефропатия – у 11, минимальные изменения – у 10, фокально-сегментарный гломерулосклероз – у 5, фибропластический гломерулонефрит – у 2, нефросклероз – у 5 больных и у 1 пациентки была диагностирована С3-нефропатия. Средний возраст больных на момент биопсии составил 37,1±17,0 лет; длительность ХГН – 3,2±5,1 года.

У 38,8% больных ПУ не превышала 1 г/сут, у 16,3% наблюдалась выраженная (более 1 г/сут) ПУ, но без нефротического синдрома (НС), у 44,9% имел место НС. Прогностически наиболее неблагоприятное сочетание НС и АГ отмечено у 21,1% обследованных больных. Гематурия (ГУ) на момент постановки диагноза наблюдалась у 61% больных ХГН. Синдром АГ (САД≥140 и/или ДАД≥90 мм рт.ст.) отмечен у 30 (35,7%) больных, в т.ч. у 13 – была АГ 2-й стадии (АД превышало 160/110 мм рт. ст.). Нарушение фильтрационной функции почек (СКФCKD-EPI<60 мл/мин/1,73 м2) на момент установления диагноза ХГН наблюдалось у 19 пациентов, у 12 из них это расценивали как проявление активности нефрита.

Активность ХГН оценивали на момент постановки диагноза по следующим критериям: минимальной активностью считали наличие ПУ<1 г/сут, эритроцитурии (ЭУ) < 30 в п/зр в сочетании с нормальным или стойко повышенным (> верхней границы нормы лаборатории, в которой производилось исследование) уровнем креатинина. Умеренную активность ХГН констатировали при ПУ от 1 до 3 г/сут и сохранной функции почек. Высокой активности ХГН соответствовало наличие ПУ≥3 г/сут или с НС и сохранной функцией почек, а очень высокой активности – наличие ПУ ≥3 г/сут, НС либо ПУ – 1–3 г/сут и ЭУ ≥30 в п/зр в сочетании с нарушением функции почек в рамках активности нефрита.

Аллели полиморфных маркеров G(-238)A гена TNF, G(-174)C гена IL6 и G(-1082)A гена IL10 идентифицировали методом ПЦР с последующим анализом длин рестрикционных фрагментов.

Выделение геномной ДНК из венозной крови обследуемых осуществляли методом фенол-хлороформной экстракции после инкубации образцов крови с протеиназой К в 0,1%-ном растворе SDS. Термостабильная ДНК-полимераза Taq получена от фирмы «Диалат» (Москва, Россия), протеиназа – К от фирмы «Диа-М» (Москва, Россия). Фрагменты геномной ДНК, содержавшие полиморфные участки генов-кандидатов, амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) на термоциклере «ABI 7500 Fast».

Амплификацию полиморфного участка G(-238)A гена TNF провели с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) «в реальном времени» на термоциклере «CFX96» (BioRad) в 10 мкл реакционной смеси следующего состава: 70 мМ Трис-HCl, pH 8,8; 16,6 мМ сульфат аммония, 0,01%-ный Твин-20, 2 мМ хлорид магния, 200 нМ каждого dNTP, 500 нМ праймеров (FJ, 5’- CCTACACACAAATCAGTCA -3’ и RJ, 5’- CAAGCATCAAGGATACCC -3’), 100 нМ зондов (FAM, FAM-5’- ctGcTcCgAtTccg -3’-BHQ1 и VIC, VIC-5’- ctGcTcTgAtTccg -3’-BHQ2) 1,5 ЕД. Taq ДНК-полимеразы, 50-100 нг геномной ДНК. Условия амплификации фрагмента ДНК: 95C/2 мин – 1-й цикл; 94C/10 с, 60C/60 – 40 циклов. Размер продукта амплификации – 90 п.н. Анализ продуктов амплификации проведен методом детекции «по конечной точке» с помощью встроенных средств программного обеспечения версии BioRad CFX Manager 3.0.

Амплификацию полиморфного участка G(-174)C гена IL6 проводили с помощью ПЦР на основе аллель специфичной ПЦР с использованием трех пар праймеров (F-внеш., GACTTCAGCTTTACTCTTTGTCAAGACA R-внеш., GCACACACAGAAGGCACTTGAATAGA, R-внутр., GAATGAGCCTCAGACATCTCCAGTCCTA) в 25 мкл реакционной смеси следующего состава: 70 мМ Трис-HCl, pH 8,8, 16,6 мМ сульфат аммония, 0,01%-ный Твин-20, 2 мМ хлорид магния, 200 нМ каждого dNTP, 500 нМ праймеров. Условия амплификации фрагмента ДНК: 95C/2 мин – 1-й цикл; 92C/10 с, 62C/15, 72С/20 – 35 циклов. Размер продукта амплификации – 326 и 205 и/или 176(С). Анализ продуктов амплификации проведен методом электрофоретического разделения.

Амплификацию полиморфного участка G(-1082)A гена IL10 проводили с помощью ПЦР «в реальном времени» на термоциклере «ABI 7500 Fast» (Applied Biosystems) в 20 мкл реакционной смеси следующего состава: 70 мМ Трис-HCl, pH 8,8; 16,6 мМ сульфат аммония, 0,01%-ный Твин-20, 2 мМ хлорид магния, 200 нМ каждого dNTP, 500 нМ праймеров (FJ, 5’- GGAAGAAGTTGAAATAACAAG -3’ и RJ, 5’- CCAAGACAACACTACTAAG -3’), 100 нМ зондов (FAM, FAM-5’- acttcCccCtcCcaaa -3’-BHQ1 и VIC, VIC-5’- acttcCccTtcCcaaa -3’-BHQ2) 1,5 ЕД Taq ДНК-полимеразы, 50-100 нг геномной ДНК. Условия амплификации фрагмента ДНК: 95C/2 мин – 1-й цикл; 94C/10 с, 60C/60 – 40 циклов. Размер продукта амплификации – 126 п.н. Анализ продуктов амплификации проведен методом детекции «по конечной точке» с помощью встроенных средств программного обеспечения версии SDS 1.4.

При статистической обработке данных для протяженных переменных рассчитаны среднее значение и стандартное отклонение (mean ± SD). Достоверность различий оценивали с помощью U-теста Манна–Уитни. Для проверки статистической значимости различий частотных показателей использовали критерий χ2 по Пирсону. Достоверными считались различия при р<0,05; 0,05≤р<0,1 рассматривали как тенденцию к различию.

Результаты

Генотипы исследуемых полиморфных маркеров генов распределялись следующим образом: частота генотипа GG полиморфного маркера G(-238)A гена TNF составила 72,5%, генотипа GA – 24,5%, генотипа AA – 3%. Генотип GG полиморфного маркера G(-174)C гена IL6 выявлен у 72,5% больных, генотип GC – у 10,8% и генотип СС – у 16,7%. Генотип GG полиморфного маркера G(-1082)A гена IL10 идентифицирован в 9,8% случаев, генотип GA – в 50% и генотип AA – в 40,2% случаев.

В связи с малым количеством гомозигот по минорным аллелям исследуемых генов дальнейший анализ проведен в следующих группах: для гена TNF – в группах GG и A (объединявшей носителей генотипов GA и AA); для гена IL6 – в группах GG и С (включившей больных генотипами GC и CC); для гена IL10 – в группах G (в которую объединили гомозигот GG с гетерозиготами GC) и AA.

При изучении особенностей клинической картины в дебюте ХГН в зависимости от полиморфного маркера G(-238)A гена TNF достоверных различий между исследуемыми группами не обнаружено.

Обнаружена тенденция к различиям активности ХГН в зависимости от генотипов полиморфного маркера G(-174)C гена IL6: в группе больных с генотипом GG частота активного ГН (выраженная ПУ/НС с сохранной функцией почек) была выше, чем у носителей аллеля С (41,9% vs. 25,0% соответственно, р=0,088), в то время как у носителей аллеля С чаще обнаруживали очень высокую активность ХГН (выраженная ПУ/НС с нарушением функцией почек) по сравнению с группой (21,4% vs. 8,1%) (р=0,069). Кроме того, по группе в целом у носителей аллеля С гена IL6 по сравнению с больными, гомозиготными по аллелю GG, на момент постановки диагноза ХГН чаще отмечалось нарушение функции почек (в 35,7 и 13% случаев соответственно, р=0,014).

У носителей генотипа АА полиморфного маркера G(-1082)A гена IL10 чаще обнаруживали АГ в дебюте ХГН (у 56,3% по сравнению с 32,2% носителей аллеля G соответственно, р=0,023). У них же наблюдалась тенденция к более частому сочетанию НС и АГ в начале заболевания (29,7% vs. 15,5% у больных группы IL10-G соответственно, р=0,082).

По данным морфологического исследования биоптата почки пациенты были объединены в две группы. Первую группу составили больные с пролиферативными вариантами ХГН (мезангиопролиферативным и мембранопролиферативным ГН, n=22), а вторую группу – пациенты с непролиферативными формами (мембранозной нефропатией, ФСГС, болезнью минимальных изменений, n=26); больных с нефросклерозом и фибропластическим ГН из этой части анализа исключили, поскольку на этой стадии определить первичную форму нефрита не представлялось возможным. Обнаружена тенденция к более частой встречаемости пролиферативных вариантов ХГН у больных генотипом GG (ген TNF) по сравнению с носителями аллеля А (46,3% и 20,0% соответственно, р=0,067), тогда как у лиц с генотипом GG (ген IL6) несколько чаще наблюдались непролифератиные формы нефрита (53,7%) по сравнению с носителями аллеля С (26,7%); р=0,067.

Обсуждение

Для гена TNF, кодирующего фактор некроза опухоли-α, – мощный провоспалительный цитокин, продуцируемый активированными макрофагами, описано несколько типов полиморфизма, среди которых наиболее изучен полиморфизм G(-308)A, влияющий на транскрипционную активность [19]. В ряде исследований показана его ассоциация с предрасположенностью к развитию ХГН [20], ответом на терапию глюкокортикостероидами [14], с повышенным риском хронического отторжения почечного трансплантата [21]. Полиморфный маркер G(-238)A гена TNF был изучен всего лишь в нескольких работах, в которых исследуемые группы включали пациентов с терминальной почечной недостаточностью (ТПН) в исходе различных первичных и вторичных нефропатий. В одной из этих работ авторы не обнаружили ассоциации данного полиморфного маркера ни с предрасположенностью к почечной недостаточности, ни с развитием сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) при ТПН [22]. Тогда как в другой – носительство генотипа АА полиморфного маркера G(-238)A было ассоциировано с повышенным риском развития ТПН [17]. В нашем исследовании не обнаружена ассоциация данного полиморфного маркера с клиническими проявлениями ХГН. Однако выявлена более высокая частота встречаемости пролиферативных вариантов ХГН у больных генотипом GG по сравнению с носителями аллеля А (46,3 и 20,0% соответственно, р=0,067), что, по-видимому, отражает более выраженное стимулирующее влияние TNF-α на пролиферацию мезангиальных клеток у носителей данного генотипа.

Данные об ассоциациях полиморфного маркера G(-174)C гена IL6, кодирующего другой медиатор воспаления – интерлейкин-6 (ИЛ-6), с поражением почек также малочисленны и противоречивы. По результатам одних исследований, с более высокими уровнями ИЛ-6 в крови ассоциировано носительство аллеля С [23], по другим – аллеля G [24]. В нескольких работах носительство аллеля С было ассоциировано с худшим прогнозом (например, более низкой выживаемостью почечного трансплантата [25]) и предрасположенностью к развитию сердечно-сосудистых заболеваний [26, 27], в т.ч. при заболеваниях почек. Так, у пациентов, получавших диализную терапию, носительство аллеля С было ассоциировано с высоким АД, гипертрофией левого желудочка и снижением функционального статуса [28]. По нашим данным, «неблагоприятным» оказалось носительство аллеля С, которое было ассоциировано с более частым нарушением функции почек в дебюте ХГН. Поскольку мы не исследовали корреляции между носительством различных генотипов исследуемого полиморного маркера и уровнем ИЛ-6 в крови, патогенетические механизмы, лежащие в основе выявленной ассоциации, требуют уточнения.

Активно изучаются ассоциации полиморфных маркеров гена IL10, кодирующего основной противовоспалительный цитокин – интерлейкин-10 (ИЛ-10), который угнетает секрецию Th1-клетками ИЛ-1, ФНО-α, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12 [29–31] и снижает активность макрофагов. Ген IL10, кодирующий синтез ИЛ-10, состоит из 5 экзонов и содержит 3 однонуклеотидных полиморфизма: С(-592)A, C(-819)T и G(-1082)A [32, 33]. Из них наиболее исследован полиморфизм G(-1082)A; обнаружено, что носительство генотипа АА ассоциировано с низким уровнем ИЛ-10 и повышенной смертностью, связанной с ССЗ, у больных ТПН [33, 34]. Полученные нами результаты свидетельствуют об ассоциации генотипа АА с АГ, а также тенденцией к более частому сочетанию НС и АГ в начале заболевания.

Таким образом, на основании полученных результатов можно сделать вывод об ассоциации полиморфных маркеров G(-238)A гена TNF, G(-174)C гена IL6 и G(-1082)A гена IL10 с показателями клинической активности и морфологичеким вариантом ХГН. Тем не менее необходимы дальнейшие исследования в более крупных выборках, в т.ч. с использованием подходов, позволяющих уточнять совокупный вклад этих (и других) генов в развитие заболевания, персонифицировать прогноз и терапевтическую тактику.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 14-04-01819).