English
Одной из наиболее важных проблем нефрологии является изучение механизмов прогрессирования хронического гломерулонефрита (ХГН) с целью поиска новых путей торможения фиброза в почке и отдаления развития терминальной почечной недостаточности, требующей применения дорогостоящей заместительной почечной терапии. В настоящее время благодаря многочисленным исследованиям, главным образом в эксперименте, подтверждено первостепенное значение тубулоинтерстициального фиброза (ТИФ) как патоморфологической основы почечной недостаточности и установлена важная роль протеинурии (ПУ) в его развитии [1]. Показано, что нефротоксический эффект ПУ реализуется через интерстициальное воспаление, заканчивающееся развитием ТИФ [2, 3].
Центральным звеном в этих механизмах является активация тубулярных эпителиальных клеток под действием повреждающих компонентов ПУ с продукцией ими молекулярных медиаторов воспаления и фиброза – моноцитарного хемотаксического протеина-1 (МСР-1) и трансформирующего фактора роста-β1 (TGF-β1), осуществляющих паракринно-аутокринную регуляцию процессов формирования и прогрессирования ТИФ [3, 4]. В основе ТИФ лежат процессы накопления компонентов экстрацеллюлярного матрикса (ЭЦМ) (фибронектина, коллагена I, III, IV типов, ламинина и гепарансульфат-протеогликанов) и апоптоз тубулярных клеток, ведущие к атрофии канальцев, расширению интерстициального объема и потере перитубулярных капилляров [5, 6].
В последние годы появилась возможность определения отдельных молекулярных медиаторов воспаления в моче больных ХГН, однако имеются лишь единичные клинические работы, демонстрирующие взаимосвязь уровня экскреции МСР-1 и TGF-β1 со степенью выраженности тубулоинтерстициального повреждения и фиброза [7, 8].
Цель исследования: Определить содержание в моче больных ХГН хемокина МСР-1 и TGF-β1, уточнить их значение для оценки интерстициального фиброза в почке и как критериев прогрессирования заболевания.
Материал и методы
Обследованы 83 больных активными формами ХГН: 49 (59 %) женщин и 34 (41 %) мужчин в возрасте от 15 до 69 лет (средний возраст – 33 ± 13,8 года). Контрольную группу составили 12 здоровых лиц, сопоставимых по полу и возрасту с обследованными больными ХГН: 6 мужчин и 6 женщин от 21 до 37 лет (средний возраст – 29 ± 5 лет). Среди 83 обследованных больных ХГН диагноз был подтвержден морфологически у 45: у 15 выявлен мезангиопролиферативный нефрит, у 10 – мезангиокапиллярный нефрит, у 6 – мембранозный нефрит, у 4 – фокально-сегментраный гломерулосклероз, у 3 – нефрит с минимальными изменениями, у 7 – фибропластический гломерулонефрит.
Результаты исследования молекулярных медиаторов сравнивали в трех группах больных, различающихся по степени активности ХГН и выраженности почечной недостаточности. Первую группу составили 26 больных с умеренным мочевым синдромом, у которых наблюдалось обострение заболевания (нарастание протеинурии, усиление гематурии). Протеинурия в этой группе составила в среднем 1,3 ± 0,2 г/сут; у 7 отмечена изолированная протеинурия субнефротического уровня, у 9 протеинурия сочеталась с умеренной эритроцитурией (до 30–40 в п/зр.) и у 10 – с выраженной эритроцитурией (сплошь все п/зр.). Функция почек у всех больных I группы была в пределах нормы (креатинин сыворотки крови – 1,06 ± 0,04 мг/дл), артериальная гипертензия (максимально до 170/100 мм рт. ст.) наблюдалась у 3 больных. Длительность нефрита в I группе составила от 1,5 месяцев до 20 лет (в среднем – 6,6 ± 1,2 года).
Во II группу включены 38 пациентов с нефротическим синдромом (НС), признаки которого были отчетливо выражены: отеки различной степени и локализации, протеинурия, в отдельных случаях достигавшая 12,0–13,5 г/сут (в среднем – 5,5 ± 0,6 г/сут), гипоальбуминемия (2,50 ± 0,11 г/дл). У 19 больных наряду с массивной протеинурией выявлено преходящее нарушение функции почек (креатинин – от 1,6 до 2,8 мг/дл, в среднем – 1,9 ± 0,07 мг/дл) как показатель высокой активности нефрита, среди них у 12 также отмечены гематурия, артериальная гипертония (остронефритический синдром). Длительность нефрита во II группе составила в среднем 2,7 ± 0,7года, длительность НС к моменту обследования – 6,60 ± 0,86 месяца.
В III группу вошли 19 пациентов с выраженной протеинурией (у 13 – нефротического уровня, в среднем – 4,6 ± 0,8 г/сут), гематурией (от 10–15 в п/зр. до сплошь в п/зр.), со стойким нарушением функции почек, в отличие от предыдущей группы (креатинин сыворотки крови в среднем 3,6 ± 0,8 мг/дл), и тяжелой артериальной гипертензией (артериальное давление (АД) систолическое – 160–220 мм рт. ст., АД диастолическое – 100–130 мм рт. ст.). При морфологическом исследовании ткани почки у больных этой группы выявлен значительный фиброз. Длительность нефрита в III группе составила в среднем 4,5 ± 1,0 год.
Уровень экскреции с мочой МСР-1 и TGF-β1 исследовали у 63 больных методом непрямого иммуноферментного анализа (ELISA). Для определения уровня МСР-1 в моче больных ХГН использовали систему BioSource International, Immunoassay Kit; США, Бельгия, для определения TGF-β1 в моче – систему анти-TGF-β1 DRG MTPL EIA-1864; ФРГ. Мочевые показатели МСР-1 и TGF-β1 были стандартизованы по величине креатинина в утренней моче.
В ткани почек 45 больных ХГН определяли экспрессию гладкомышечного α-актина (α-ГМА) – маркера миофибробластов. У 16 больных параллельно исследованию TGF-β1 в моче провели изучение этого цитокина в ткани почки. Оба показателя изучили иммуногистохимическим пероксидазным методом с использованием моноклональных антител мыши к α-ГМА (клон 1А4; DAКO, Дания) и TGF-β1 (клон TB21; BioSource International,USA, Belgium). Результат реакции оценивали морфометрически – по интенсивности коричневой окраски. Среди 45 больных ХГН, которым была проведена биопсия почки, у 25 измеряли площадь (относительный объем) интерстиция коркового слоя почки (в 10–12 полях зрения при увеличении × 400) и степень клеточной воспалительной лейкоцитарной инфильтрации по количеству ядер в корковом слое почек на участке в 1,5 мм2 с использованием программ для морфометрии (ДиаМОРФ, ADOBE PHOTOSHOP CS).
Результаты
Во всех группах больных ХГН уровень экскреции МСР-1 с мочой был выше, чем у здоровых лиц, и зависел от степени активности нефрита. Так, у пациентов с нефротическим синдромом (НС) он был достоверно выше, чем у больных с умеренным мочевым синдромом, а наиболее высокая мочевая экскреция МСР-1 отмечена в III группе, характеризующейся выраженной ПУ и стойкой почечной недостаточностью (табл. 1). Установлена прямая достоверная корреляция между уровнем МСР-1 в моче и показателем ПУ/креатинин мочи (rS = 0,55 p < 0,001). Связь уровня МСР-1 в моче с высокой активностью нефрита была особенно очевидной при рассмотрении этого показателя отдельно в группе больных с НС. У пациентов с НС и преходящей почечной недостаточностью, т. е. у больных с наибольшей клинической активностью нефрита, он был достоверно выше [11,0 пг/мл (7,2–29)], чем у больных с сохранной функцией почек [6,5 пг/мл (3,1–10,5)], p < 0,05.
Величина экскреции МСР-1 с мочой при всех морфологических типах ХГН прямо коррелировала с выраженностью клеточной воспалительной инфильтрации в интерстиции почек, что подтверждает ведущую роль МСР-1 в формировании интерстициального воспаления с исходом в фиброз (rS = 0,71, p < 0,001). О значении данного механизма в формировании интерстициального фиброза свидетельствуют и результаты проведенного нами морфометрического анализа. У больных с площадью интерстиция более 20 % экскреция с мочой МСР-1 была достоверно выше, чем у больных с меньшей площадью интерстиция (фиброза) (рис. 1). Между этими показателями выявлена сильная прямая корреляция (rS = 0,8, p < 0,001). Нами также проведен анализ показателей экскреции МСР-1 в зависимости от локализации фиброзных изменений в клубочках и интерстиции почек: экскреция МСР-1 с мочой была значительно выше при наличии тубулоинтерстициального фиброза (табл. 2).
Уровень экскреции с мочой TGF-β1 у больных ХГН был достоверно выше, чем у здоровых лиц. Этот показатель не зависел от величины ПУ: у больных с умеренным мочевым и нефротическим синдромами (I и II группы) он практически не отличался, но был значимо выше у пациентов III группы с НС и стойкой почечной недостаточностью (табл. 1). Выявлены прямая корреляция между показателем экскреции TGF-β1 и уровнем сывороточного креатинина (rS = 0,5, p < 0,05), а также обратная корреляция между ним и скоростью клубочковой фильтрации, рассчитанной по Кокрофту–Гоулту (rS = -0,6, p < 0,01). Высокий уровень TGF-β1 в моче обнаружен у больных ХГН с его преимущественной экспрессией в интерстиции почки (рис. 2), что подтверждает, с одной стороны, локально-почечное происхождение этого цитокина в моче, с другой – его участие в формировании интерстициального фиброза. Экскреция TGF-β1 с мочой была значительно выше у больных с площадью интерстиция более 20 %, то есть при выраженном интерстициальном фиброзе (табл. 2). Таким образом, экскреция с мочой этого профиброгенного фактора роста зависела в основном от степени почечной недостаточности и выраженности фиброза в интерстиции почки.
В интерстиции почек больных ХГН мы также изучили содержание основных продуцентов ЭЦМ – миофибробластов, экспрессирующих α-ГМА. Наиболее высокой интерстициальная экспрессия α-ГМА была у больных II группы с НС и преходящей почечной недостаточностью [21,6 % (21,4–24,2)], а также у больных III группы со стойкой почечной недостаточностью [25,3 % (18,6–31,7 %)], т. е. высокоактивными прогрессирующими формами ХГН. Именно у этих больных отмечена прямая корреляция между количеством миофибробластов в интерстиции и уровнем креатинина сыворотки крови (rS = 0,7, p < 0,001). При морфометрическом исследовании у пациентов с площадью ТИФ более 20 % экспрессия α-ГМА была достоверно выше [22,2 % (19,5–24,7)], чем у больных с меньшей площадью фиброза [8,8 % (6,6–11)], р < 0,0001.
О содружественном участии МСР-1 и TGF-β1 в ремоделировании тубулоинтерстиция свидетельствует выявленная нами прямая корреляция между показателями экскреции с мочой этих цитокинов у больных с почечной недостаточностью (rS = 0,6, p < 0,01), а также площадью интерстиция и инфильтрацией тубулоинтерстиция миофибробластами (rS = 0,7, p < 0,01). Кроме того, экспрессия α-ГМА клетками канальцев почек отмечена именно у больных с высоким содержанием TGF-β1 в моче. Это подтверждает установленный, преимущественно в эксперименте, факт трансформации под влиянием TGF-β1 клеток тубулярного эпителия в миофибробласты, которые пополняют пул интерстициальных миофибробластов, продуцирующих ЭЦМ.
С целью определения информативности изученного нами метода оценки тубулоинтерстициального фиброза в почке при ХГН мы рассчитали специфичность и чувствительность тех показателей МСР-1 и TGF-β1 в моче, которые с высокой точностью отражают накопление ТИФ (площадь интерстиция – более 20 % коркового слоя). Для концентрации МСР-1 в моче дискриминационный уровень составил 20,0 пг/мл (чувствительность и специфичность для оценки выраженного ТИФ – 100 и 89 % соответственно), для TGF-β1 – выше 2,0 пг/мл (чувствительность – 83 %, специфичность – 78 %). Далее мы попытались установить минимальные концентрации в моче обоих цитокинов, свидетельствующие о ранних фиброзных изменениях в почечном интерстиции. Установлено, что МСР-1 уже с уровня 4,0 пг/мл может отражать увеличение площади интерстиция (более 10 % общей площади коркового слоя) и может быть использован как маркер ранней фазы формирования фиброза. В то же время более низкие концентрации TGF-β1 в моче оказались недостаточно чувствительными (56 %) и специфичными (50 %) в оценке начальной стадии ТИФ. По нашему мнению, только уровень TGF-β1 в моче более 2,0 пг/мл информативен как маркер ТИФ, указывая на уже сформированный фиброз.
Обсуждение
Изучение молекулярных механизмов прогрессирования ХГН, среди которых важное место отводят профиброгенным цитокинам (хемокины, факторы роста), считают перспективным направлением в нефрологии. Интерес к этой проблеме значительно возрос в связи с появлением доступных методов определения уровня цитокинов в моче и ткани почки (иммунохимические методы, гибридизации in situ и др.), позволяющих проводить оценку выраженности локально-почечных воспалительных и фиброзных изменений. При этом неинвазивное мониторирование этих процессов с помощью оценки мочевых биомаркеров в моче может способствовать наиболее раннему выявлению больных ХГН с высоким риском развития почечной недостаточности для определения и дальнейшей коррекции тактики ведения этих пациентов.
Благодаря экспериментальным исследованиям последних лет очерчен круг молекулярных медиаторов, участвующих в процессе протеинурического ремоделирования тубулоинтерстиция, среди которых ключевое значение придают профиброгенному хемокину МСР-1 и TGF-β1. МСР-1 регулирует основные этапы острого и хронического воспаления в почке, непосредственно участвует в формировании воспалительной инфильтрации моноцитами (макрофагами) и лимфоцитами, активации эндотелия и гладкомышечных клеток сосудов, накоплении ЭЦМ, ведущими к гломерулосклерозу и ТИФ [4, 9]. Установлено, что МСР-1 вовлечен в прогрессирование ХГН, главным образом за счет тубулоинтерстициального повреждения [9, 10]. Как показали данные морфологических исследований ткани почки у больных ХГН, МСР-1 экспрессируется преимущественно тубулярным эпителием, мононуклеарными клетками в зонах интерстициального воспаления, а также эндотелием сосудов интерстиция и практически не продуцируется клетками клубочка [7]. В эксперименте на модели нефротоксического нефрита было установлено, что при одинаковой степени гломерулярных изменений более выраженное тубулоинтерстициальное повреждение развивается у мышей “дикого” типа, способных к экспрессии MCP-1, по сравнению с трансгенными мышами, не синтезирующими MCP-1 [10].
В культуре монослоя поляризованных тубулярных клеток показано, что секреция ими МСР-1 происходит под воздействием компонентов протеинурии, в частности альбумина. Предполагают, что МСР-1, секретируемый на апикальной поверхности тубулярных клеток, является основным его источником в моче [11, 12]. С базолатеральной поверхности тубулоцитов МСР-1 попадает в интерстиций и способствует образованию в нем воспалительного инфильтрата [4].
В нашем исследовании уровень МСР-1 в моче нарастал по мере увеличения величины суточной протеинурии, что согласуется с результатами других клинических и экспериментальных работ [13]. Выявленные прямые корреляции между величиной суточной экскреции белка, а также степенью воспалительной клеточной инфильтрации интерстиция подтверждают существование при ХГН патогенетической цепи “протеинурия–тубулярная секреция MCP-1–интерстициальное воспаление” и указывают на возможность оценки интерстициальных изменений с помощью изучения в моче именно этого хемокина.
Профиброгенное действие МСР-1 объясняют вызываемой им активацией синтеза макрофагами TGF-β1 [14–16]. В условиях повышенной продукции TGF-β1 происходит трансформация резидентных фибробластов в миофибробласты основные профиброгенные клетки, обладающие способностью в большом количестве продуцировать компоненты ЭЦМ [14, 17]. Мы выявили прямую сильную корреляцию между мочевыми показателями МСР-1 и TGF-β1 у больных с нарушением функции почек, и именно у этих больных при исследовании биоптатов почек нами обнаружен фиброз интерстиция.
В нашем исследовании экспрессия TGF-β1 в интерстиции почки выявлена у больных ХГН с высоким его уровнем в моче, тогда как у здоровых лиц и у пациентов с низким уровнем ТGF-β1 в моче мы не обнаружили его экспрессии в интерстиции почки, что указывает на локально-почечное, преимущественно интерстициальное, происхождение этого мочевого показателя. Полученные данные подтверждены нами и морфометрическим исследованием, показавшим, что уровень экскреции TGF-β1 был значительно выше у больных с площадью интерстиция более 20 %, т. е. при выраженном интерстициальном фиброзе. Прямые корреляции между уровнем экскреции TGF-β1 с мочой и уровнем сывороточного креатинина, а также площадью интерстиция указывают на возможность использования мочевого показателя TGF-β1 для оценки выраженности фиброзных изменений в интерстиции почки и риска прогрессирования ХГН.
У больных ХГН мы оценили в интерстиции почки экспрессию α-ГМА как показателя накопления миофибробластов. Степень его экспрессии зависела от активности заболевания. Самый высокий показатель экспрессии α-ГМА в интерстиции выявлен у больных с выраженным интерстициальным фиброзом и стойкой почечной недостаточностью. При иммуногистохимическом исследовании интенсивное окрашивание α-ГМА обнаружено не только в интерстиции, но и на поверхности тубулярного эпителия. Можно полагать, что высокие показатели TGF-β1 в моче в более поздней фазе ТИФ у больных с почечной недостаточностью и морфологически доказанным интерстициальным фиброзом объясняются проникновением этого фактора в мочу через многочисленные разрывы тубулярной базальной мембраны, возникающие в процессе миграции трансдифференцированных тубулярных клеток (миофибробластов). Аргументом в пользу совместного участия МСР-I- и TGF-β1 в накоплении в интерстиции почки миофибробластов под влиянием протеинурии служат выявленные нами прямые корреляции между этими медиаторами в моче, экспрессией в ткани α-ГМА и площадью интерстиция.
Исходя из полученных нами данных о ключевой роли в развитии ТИФ двух профиброгенных цитокинов МСР-1 и TGF-β1, мы оценили информативность уровня этих медиаторов в моче с точки зрения возможности мониторирования фиброгенеза при ХГН.
Было показано, что как маркер ранней фазы формирования фиброза (площадь интерстиция > 10 %) может служить уровень МСР-1 в моче, начиная с 4,0 пг/мл. Именно этот показатель отражает выраженность клеточной воспалительной реакции в интерстициальной ткани почки с усилением процессов фиброзирования (ранняя стадия ТИФ) и обосновывает проведение активной иммуносупрессивной терапии наряду с воздействием на общие патогенетические пути прогрессирования ХГН (программа нефропротекции).
Прогностически неблагоприятными признаками, указывающими на прогрессирование фиброза в почке, наряду с ухудшением функции почек является высокий уровень в моче МСР-1 (более 20,0 пг/мл) в сочетании с повышенной экскрецией TGF-β1 (более 2,0 пг/мл). Выявление этого спектра молекулярных медиаторов в моче отражает развернутую стадию ТИФ в почке и является показанием к преимущественно нефропротективной стратегии (ингибиторы АПФ, БРА, статины и др.).
Заключение
В целом результаты нашего исследования подтверждают, что формирование индуцируемого протеинурией тубулоинтерстициального фиброза – динамический процесс, а использование мочи как субстрата, тесно связанного с больным органом, может предоставить ценную информацию о динамике морфологических изменений в почке. Определено значение мочевых МСР-1 и TGF-β1 как важных биомаркеров, позволяющих доступным неинвазивным методом мониторировать стадии воспаления и фиброза в почке, что имеет несомненное практическое значение для оценки прогноза и определения тактики лечения больных ХГН. Подтверждение ключевой роли молекулярных медиаторов в механизмах протеинурического ремоделирования почечного тубулоинтерстиция открывает перспективу применения для лечения больных ХГН средств, целенаправленно воздействующих на хемокины, факторы роста и др. Некоторые из них, в частности антихемокиновые препараты, уже сегодня проходят клиническую апробацию.
