Русский
Введение
Для нормальной деятельности организма жизненной необходимостью является поддержание уровня кальция крови в пределах нормы. Важную роль в этом процессе играют паращитовидные железы (ПЩЖ), которые реагируют на уровень кальция в крови благодаря кальций-чувствительным рецепторам (CaSR). CaSR - поверхностный гликопротеин с массой 120 кДа, содержащий 1078 аминокислот и связанный с G-белком. Ген, кодирующий его, располагается на длинном плече 3-й хромосомы и занимает более 50 кб геномной ДНК [1, 2]. CaSR в основном располагаются в ПЩЖ и в меньшей степени — в клетках почечных канальцев [3]. Они участвуют в поддержании уровня внеклеточного кальция путем активации секреции в ПЩЖ паратгормона (ПТГ). ПТГ в свою очередь взаимодействует со специфическими G-белок-связанными рецепторами ПТГР-1, приводя к усилению в канальцах почек реабсорбции кальция и экскреции фосфатов. Это вызывает быстрое увеличение уровней общего и ионизированного кальция крови, подавляя дальнейший выброс ПТГ [4, 5].
Эффективность функции CaSR напрямую зависит от степени их экспрессии на поверхности клеток. При хронической болезни почек (ХБП) экспрессия CaSR снижается, и это играет ключевую роль в развитии вторичного гиперпаратиреоза. Различные активирующие или инактивирующие мутации в гене CaSR могут также приводить к нарушению функции ПЩЖ и неправильной регуляции уровня кальция в крови [6], вызывая такие заболевания, как доброкачественная семейная гипокальциурическая гиперкальциемия, тяжелый наследственный неонатальный гиперпаратиреоз и аутосомно-доминантный гипопаратиреоз [5, 7]. Описано шесть однонуклеотидных полиморфизмов в гене CaSR: один — в 5-м интроне, остальные — в 7-м экзоне [8]. Обнаружено, что три из них, в 7-м экзоне (A986S, R990G, Q1011E), могут изменять аминокислотный состав внутриклеточного концевого сегмента CaSR, тем самым влияя на его чувствительность к ионам кальция [9]. Частота встречаемости этих трех полиморфизмов варьируется в различных популяциях. В отечественной литературе мы не нашли работ, посвященных изучению этой проблемы.
Целью данного исследования было определение частоты встречаемости трех полиморфизмов, A986S, R990G и Q1011E, в группе детей, больных ХБП II—V стадий, а также изучение влияния этих полиморфизмов на уровень ПТГ в крови.
Материал и методы
ХАРАКТЕРИСТИКА ПАЦИЕНТОВ
Обследованы 80 детей (44 мальчика, 36 девочек), наблюдавшихся в отделениях нефрологии и пересадки почки Российской детской клинической больницы с 2008 по 2011 г. Средний возраст детей составил 11,5 ± 4,2 (1,6—17,3) года. Всем детям был поставлен диагноз “хроническая болезнь почек”. В группе было 3 детей с ХБП II стадии, 15 — с ХБП III стадии, 7 — с ХБП IV стадии и 55 — с ХБП V стадии. Сорок детей группы ХБП V стадии получали заместительную терапию диализом (31 — гемодиализом, 9 — перитонеальным диализом). Длительность лечения диализом составила 12,9 ± 11,5 (0,5—46,0) месяцев. Оставшимся 15 детям, больным ХБП V стадии, планировалось введение в программу диализной терапии.
Для всех пациентов определены такие показатели, как ПТГ, общий Са, Р, щелочная фосфатаза (ЩФ) в крови, Са х Р и скорость клубочковой фильтрации (СКФ). Уровни Са, Р и ЩФ в крови определены стандартными методами. Уровень интактного ПТГ в крови измерялся методом иммуноферментного анализа (Diagnostic Systems Laboratories, Inc.). Стадия ХБП определялась в зависимости от СКФ, вычисляемой по формуле Шварца.
Детям, находившимся на гемодиализе, забор крови проведен перед началом процедуры диализа.
Все дети получали лечение с целью коррекции фосфорнокальциевого обмена. Большинство из них принимали активные метаболиты витамина Д и препараты кальция, за исключением тех, у кого отмечена гиперфосфатемия. Эти больные получали фосфор-связывающие препараты.
В зависимости от уровня ПТГ все пациенты были разделены на две группы: 70 детей — с вторичным гиперпаратиреозом (ПТГ > 62 пг/мл), 10 больных — с гипопаратиреозом (ПТГ < 62 пг/мл).
В качестве контрольной группы использовали выборку из 40 человек (14 мужчин и 26 женщин), средний возраст — 32,9 ±11,5 (22—45) лет, без хронических заболеваний почек.
АНАЛИЗ ДНК
Геномная ДНК была выделена из лейкоцитов крови с использованием коммерческого набора ДНК-сорб В фирмы “Интерлабсервис”, Россия, по инструкции. Амплификация интересующего фрагмента гена проведена с использованием праймеров 5’-TCACACAGGAAACAGCTATGAC GGTCACCTTCTCACTGAGCTT -3’-Casr 21 (прямой) и 5’-GAGCTGTTGGGTGGGATAGAAC-3’-Casr 22 (обратный) по программе - 95*С-3 минуты и 35 циклов 95*С-20 секунд, 64*С-30*, 72*С-40 секунд с использованием 1,25 ЕД на реакцию в реакционном объеме 25 мкл фермента HS Taq полимераза фирмы “Евроген”, Россия. Полученные ПЦР-фрагменты были очищены с использованием хроматографических колонок Ulustra Microspin S-300 HR фирмы “Life Technologies”, США; сиквенс фрагментов проведен с праймера М13 forv: 5’-TCACACAGGAAACAGCTATGAC-3’ при использовании набора v3.1 по стандартной программе фирмы “Applied Biosystems”, США. Электрофорез проведен на генетическом анализаторе ABI Prizm 3130.
СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ
Статистическая обработка данных проведена при помощи компьютерной программы для статистического анализа “Statistica 7,0”. Для проверки статистической значимости различий частотных показателей использован критерий χ2 по Пирсону. При количестве наблюдений меньше 5 использовался точный критерий Фишера. Достоверными считались различия при р < 0,05; 0,05; р < 0,1 рассматривали как тенденцию к различию.
Для описания относительного риска развития заболевания рассчитывали отношение шансов (OR). Вычисления произведены с помощью программы Calculator for confidence intervals of odds ratio (David Hutchon). OR = 1 рассматривали как отсутствие ассоциации; OR > 1 — как положительную ассоциацию (“повышенный риск развития патологии”), OR < 1 — как отрицательную ассоциацию аллеля или генотипа с заболеванием (“пониженный риск развития патологии”). Кроме того, рассчитана величина доверительного интервала (CI, confidence interval) — интервала значений, в пределах которого с вероятностью 95 % находится ожидаемое значение рассматриваемого параметра, в данном случае — значение OR.
Результаты и обсуждение
Нами был проведен анализ трех полиморфизмов гена CaSR: A986S, R990G и Q1011E. В результате не было обнаружено достоверных различий в распределении частот аллелей и генотипов в общей группе больных по сравнению с контрольной (табл.1).
Таблица 1. Распределение частот генотипов и аллелей A986S, R990G, Q1011E гена CaSR среди детей с ХБП II-V стадий по сравнению с контрольной группой.
При исследовании частот аллелей и генотипов в группе больных гиперпаратиреозом также не было выявлено достоверных различий (табл. 2).
Таблица 2. Распределение частот генотипов и аллелей A986S, R990G, Q1011E гена CaSR в группе детей с ХБП с гиперпаратиреозом по сравнению с контрольной группой.
Но анализ группы детей с гипопаратиреозом определил увеличение частоты аллеля G и генотипа RG 990 по сравнению с группами контроля и гиперпаратиреоза. Частота аллеля G составила 25 % в группе гипопаратиреоза, 6,2 % — в группе контроля (χ2 = 6,25, р = 0,01) и 9,3 % — в группе гиперпаратиреоза (χ2 = 4,33, р = 0,04) (табл. 3, 4).
Таблица 3. Распределение частот генотипов и аллелей A986S, R990G, Q1011E гена CaSR в группе детей с ХБП, с гипопаратиреозом по сравнению с контрольной группой.
Частота генотипа RG составила 50 % в группе гипопаратиреоза, 12,5 % — в группе контроля (χ2 = 7,03, р = 0,008) и 18,6 % — в группе гиперпаратиреоза (χ2 = 4,96, р = 0,03) (табл. 3, 4).
Таблица 4. Распределение частот генотипов и аллелей A986S, R990G и Q1011E гена CaSR в группе детей с ХБП и гиперпаратиреозом по сравнению с группой гипопаратиреоза.
Известно, что прогрессирование вторичного гиперпаратиреоза у разных пациентов с ХБП происходит неодинаково, что в т. ч. может быть объяснено влиянием генетических факторов. Например, есть исследования, доказывающие связь между полиморфизмами гена рецептора витамина Д и уровнем ПТГ в крови пациентов на гемодиализе [10, 11].
С тех пор как был открыт CaSR и изучена его роль в поддержании уровня кальция в организме, начались исследования влияния полиморфизмов его гена на фосфорно-кальциевый обмен. Несмотря на количество этих исследований, полученные в них сведения довольно противоречивы. В одних показана связь между полиморфизмом A986S и уровнем кальция в крови у здоровых женщин, а также костной массой у женщин в периоде постменопаузы [12, 13], другие это опровергали [14]. В 2000 г. S. Yano et al. исследовали связь полиморфизмов гена CaSR с уровнем ПТГ в крови пациентов на диализе. Они выявили зависимость между повышенным уровнем ПТГ и двумя видами генотипов: RR-аллелем в полиморфизме R990G и С-аллелем в полиморфизме T/C 4 интрона [15]. Однако в 2002 г. K. Yokoyama et al. не нашли никаких различий между уровнями кальция, фосфата и ПТГ в крови пациентов с различными генотипами R990G [16]. В 2006 г. S. Corbetta et al., исследуя генотип больных первичным гиперпаратиреозом в Италии, выявили, что гомо- и гетерозиготы с аллелем 990G, приводящим к замене аргинина на глицин во внутриклеточном концевом сегменте CaSR, демонстрировали более низкий уровень ПТГ и более высокий уровень экскреции кальция с мочой, что приводило к развитию нефролитиаза у больных [17]. Сходные данные получены и в японской популяции, в которой данный полиморфизм встречается намного чаще, чем в европейской [18]. P.A. Eren et al. в 2009 г. отметил достоверную зависимость между повышенными уровнями ПТГ, кальция в крови и генотипами RR990 (аргинин вместо глицина) и QQ1011 (глутамин вместо глутаминовой кислоты) у пациентов с ХБП V стадии. Наиболее тяжелые формы вторичного гиперпаратиреоза отмечены у больных с сочетанием генотипов RR990 и QQ1011. Было сделано предположение, что молекула CaSR с глицином вместо аргинина во внутриклеточном концевом сегменте становится более чувствительной к ионам кальция [8].
Результаты нашего исследования согласуются с данными, полученными в работах итальянских и японских ученых [17, 18]. Как и у них, в группе наших пациентов выявлена зависимость между аллелем G в 990-м полиморфизме и пониженным уровнем ПТГ у больных ХБП. И так же как у них, в нашей работе не отмечено связи между уровнем ПТГ и полиморфизмом A986S. С другой стороны, нами не было выявлено зависимости между повышением уровня ПТГ и генотипами RR990 и QQ1011, что может быть связано с небольшой численностью больных. В других работах исследуемые группы были более многочисленны (192 человека в исследовании P.A. Eren, 122 — в исследовании Sh. Yano).
Таким образом, результаты проведенного нами исследования позволяют говорить о существовании связи между полиморфизмом гена CaSR и нарушениями фосфорно-кальциевого обмена у больных ХБП. С аллелем G в 990-м полиморфизме ассоциированы более низкий уровень ПТГ в крови и склонность таких пациентов к гипопаратиреозу. Лечение с учетом наличия данного полиморфизма может быть более эффективным для коррекции костно-минеральных нарушений у детей с ХБП.
