Роль полиморфного маркера R990G гена кальций-чувствительного рецептора в регуляции уровня паратгормона у детей с хронической болезнью почек II–V cтадий


М.С. Молчанова, Е.Е. Тихомиров, Л.П. Быкова, Е.А. Молчанова, А.Л. Румянцев, А.Л. Валов, Д.Б. Эктов, В.А. Гаврилова, Ю.Б. Юрасова, Э.К. Петросян

ГБОУ ВПО “Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова” Минздравсоцразвития России, Москва; ГУ “Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского” Минздравсоцразвития России, Москва; ФГУ “Российская детская клиническая больница” Минздравсоцразвития России, Москва
Цель. Определение частоты встречаемости трех полиморфизмов, A986S, R990G и Q1011E, в группе детей с хронической болезнью почек (ХБП) II–V стадий, а также изучение влияния этих полиморфизмов на уровень паратиреоидного гормона (ПТГ) в крови.
Материал и методы. В исследование были включены 80 детей с ХБП II–V стадий (44 мальчика, 36 девочек). Средний возраст – 11,5 ± 4,2 (1,6–17,3) года. В качестве контрольной группы использовали выборку из 40 человек (14 мужчин и 26 женщин), средний возраст – 32,9 ± 11,5 (22–45) лет, без хронических заболеваний почек. Исследовались A986S, R990G и Q1011E полиморфизмы кальций-чувствительного рецептора методом сиквенса. У всех пациентов определялся ПТГ. В зависимости от его уровня дети были разделены на две группы: 70 детей с вторичным гиперпаратиреозом (ПТГ > 62 пг/мл), 10 больных с гипопаратиреозом (ПТГ < 62 пг/мл).
Результаты. Нами не выявлено достоверных различий в распределении частот аллелей и генотипов в общей группе больных по сравнению с контрольной группой и в группе больных с гиперпаратиреозом. При анализе группы детей с гипопаратиреозом отмечено увеличение частоты аллеля G и генотипа RG990 по сравнению с группами контроля и гиперпаратиреозом. Частота аллеля G составила 25 % в группе с гипопаратиреозом, 6,2 % – в группе контроля (χ2 = 6,25, р = 0,01) и 9,3 % – в группе гиперпаратиреоза (χ2 = 4,33, р = 0,04). Частота генотипа RG составила 50 % в группе с гипопаратиреозом, 12,5 % – в группе контроля (χ2 = 7,03, р = 0,008) и 18,6 % – в группе гиперпаратиреоза (χ2 = 4,96, р = 0,03).
Заключение. У детей с ХБП существует связь между полиморфизмом гена кальций-чувствительного рецептора и нарушениями фосфорно-кальциевого обмена: носительство аллелем G990-аллеля сопряжено с более низким уровнем ПТГ в крови и склонностью к гипопаратиреозу.

Введение

Для нормальной деятельности организма жизненной необ­ходимостью является поддержание уровня кальция крови в пределах нормы. Важную роль в этом процессе играют паращитовидные железы (ПЩЖ), которые реагируют на уровень кальция в крови благодаря кальций-чувствительным рецепторам (CaSR). CaSR - поверхностный гликопротеин с массой 120 кДа, содержащий 1078 аминокислот и связанный с G-белком. Ген, кодирующий его, располагается на длинном плече 3-й хромосомы и занимает более 50 кб геномной ДНК [1, 2]. CaSR в основном располагаются в ПЩЖ и в меньшей степени — в клетках почечных канальцев [3]. Они участвуют в поддержании уровня внеклеточного кальция путем активации секреции в ПЩЖ паратгормона (ПТГ). ПТГ в свою очередь взаимодействует со специфическими G-белок-связанными рецепторами ПТГР-1, приводя к усилению в канальцах почек реабсорбции кальция и экскреции фосфатов. Это вызывает быстрое увеличение уровней общего и ионизированного каль­ция крови, подавляя дальнейший выброс ПТГ [4, 5].

Эффективность функции CaSR напрямую зависит от степени их экспрессии на поверхности клеток. При хронической болезни почек (ХБП) экспрессия CaSR снижается, и это играет ключе­вую роль в развитии вторичного гиперпаратиреоза. Различные активирующие или инактивирующие мутации в гене CaSR могут также приводить к нарушению функции ПЩЖ и неправильной регуляции уровня кальция в крови [6], вызывая такие заболе­вания, как доброкачественная семейная гипокальциурическая гиперкальциемия, тяжелый наследственный неонатальный гиперпаратиреоз и аутосомно-доминантный гипопаратиреоз [5, 7]. Описано шесть однонуклеотидных полиморфизмов в гене CaSR: один — в 5-м интроне, остальные — в 7-м экзоне [8]. Обнаружено, что три из них, в 7-м экзоне (A986S, R990G, Q1011E), могут изменять аминокислотный состав внутрик­леточного концевого сегмента CaSR, тем самым влияя на его чувствительность к ионам кальция [9]. Частота встречаемости этих трех полиморфизмов варьируется в различных популяциях. В отечественной литературе мы не нашли работ, посвященных изучению этой проблемы.

Целью данного исследования было определение частоты встречаемости трех полиморфизмов, A986S, R990G и Q1011E, в группе детей, больных ХБП II—V стадий, а также изучение влияния этих полиморфизмов на уровень ПТГ в крови.

Материал и методы

ХАРАКТЕРИСТИКА ПАЦИЕНТОВ

Обследованы 80 детей (44 мальчика, 36 девочек), наблюдав­шихся в отделениях нефрологии и пересадки почки Российской детской клинической больницы с 2008 по 2011 г. Средний возраст детей составил 11,5 ± 4,2 (1,6—17,3) года. Всем детям был поставлен диагноз “хроническая болезнь почек”. В группе было 3 детей с ХБП II стадии, 15 — с ХБП III стадии, 7 — с ХБП IV стадии и 55 — с ХБП V стадии. Сорок детей группы ХБП V стадии получали заместительную терапию диализом (31 — гемодиализом, 9 — перитонеальным диализом). Длительность лечения диализом составила 12,9 ± 11,5 (0,5—46,0) месяцев. Оставшимся 15 детям, больным ХБП V стадии, планировалось введение в программу диализной терапии.

Для всех пациентов определены такие показатели, как ПТГ, общий Са, Р, щелочная фосфатаза (ЩФ) в крови, Са х Р и скорость клубочковой фильтрации (СКФ). Уровни Са, Р и ЩФ в крови определены стандартными методами. Уровень интактного ПТГ в крови измерялся методом иммуноферментного анализа (Diagnostic Systems Laboratories, Inc.). Стадия ХБП определялась в зависимости от СКФ, вычисляемой по формуле Шварца.

Детям, находившимся на гемодиализе, забор крови проведен перед началом процедуры диализа.

Все дети получали лечение с целью коррекции фосфорно­кальциевого обмена. Большинство из них принимали активные метаболиты витамина Д и препараты кальция, за исключением тех, у кого отмечена гиперфосфатемия. Эти больные получали фосфор-связывающие препараты.

В зависимости от уровня ПТГ все пациенты были разделены на две группы: 70 детей — с вторичным гиперпаратиреозом (ПТГ > 62 пг/мл), 10 больных — с гипопаратиреозом (ПТГ < 62 пг/мл).

В качестве контрольной группы использовали выборку из 40 человек (14 мужчин и 26 женщин), средний возраст — 32,9 ±11,5 (22—45) лет, без хронических заболеваний почек.

АНАЛИЗ ДНК

Геномная ДНК была выделена из лейкоцитов крови с использованием коммерческого набора ДНК-сорб В фирмы “Интерлабсервис”, Россия, по инструкции. Амплификация интересующего фрагмента гена проведена с использо­ванием праймеров 5’-TCACACAGGAAACAGCTATGAC GGTCACCTTCTCACTGAGCTT -3’-Casr 21 (прямой) и 5’-GAGCTGTTGGGTGGGATAGAAC-3’-Casr 22 (обратный) по программе - 95*С-3 минуты и 35 циклов 95*С-20 секунд, 64*С-30*, 72*С-40 секунд с использованием 1,25 ЕД на реакцию в реакционном объеме 25 мкл фермента HS Taq полимераза фирмы “Евроген”, Россия. Полученные ПЦР-фрагменты были очищены с использованием хроматографических коло­нок Ulustra Microspin S-300 HR фирмы “Life Technologies”, США; сиквенс фрагментов проведен с праймера М13 forv: 5’-TCACACAGGAAACAGCTATGAC-3’ при использова­нии набора v3.1 по стандартной программе фирмы “Applied Biosystems”, США. Электрофорез проведен на генетическом анализаторе ABI Prizm 3130.

СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

Статистическая обработка данных проведена при помо­щи компьютерной программы для статистического анализа “Statistica 7,0”. Для проверки статистической значимости различий частотных показателей использован критерий χ2 по Пирсону. При количестве наблюдений меньше 5 использовался точный критерий Фишера. Достоверными считались различия при р < 0,05; 0,05; р < 0,1 рассматривали как тенденцию к различию.

Для описания относительного риска развития заболева­ния рассчитывали отношение шансов (OR). Вычисления произведены с помощью программы Calculator for confidence intervals of odds ratio (David Hutchon). OR = 1 рассматривали как отсутствие ассоциации; OR > 1 — как положительную ассоциацию (“повышенный риск развития патологии”), OR < 1 — как отрицательную ассоциацию аллеля или генотипа с заболеванием (“пониженный риск развития патологии”). Кроме того, рассчитана величина доверительного интервала (CI, confidence interval) — интервала значений, в пределах которого с вероятностью 95 % находится ожидаемое значение рассмат­риваемого параметра, в данном случае — значение OR.

Результаты и обсуждение

Нами был проведен анализ трех полиморфизмов гена CaSR: A986S, R990G и Q1011E. В результате не было обнаружено достоверных различий в распределении частот аллелей и гено­типов в общей группе больных по сравнению с контрольной (табл.1).

Таблица 1. Распределение частот генотипов и аллелей A986S, R990G, Q1011E гена CaSR среди детей с ХБП II-V стадий по сравнению с контрольной группой.

При исследовании частот аллелей и генотипов в группе больных гиперпаратиреозом также не было выявлено достоверных различий (табл. 2).

Таблица 2. Распределение частот генотипов и аллелей A986S, R990G, Q1011E гена CaSR в группе детей с ХБП с гиперпаратиреозом по сравнению с контрольной группой.

Но анализ группы детей с гипопаратиреозом определил увеличение частоты аллеля G и генотипа RG 990 по сравнению с группами контроля и гиперпаратиреоза. Частота аллеля G составила 25 % в группе гипопаратиреоза, 6,2 % — в группе контроля (χ2 = 6,25, р = 0,01) и 9,3 % — в группе гиперпаратиреоза (χ2 = 4,33, р = 0,04) (табл. 3, 4).

Таблица 3. Распределение частот генотипов и аллелей A986S, R990G, Q1011E гена CaSR в группе детей с ХБП, с гипопаратиреозом по сравнению с контрольной группой.

Частота генотипа RG составила 50 % в группе гипопаратиреоза, 12,5 % — в группе контроля (χ2 = 7,03, р = 0,008) и 18,6 % — в группе гиперпаратиреоза (χ2 = 4,96, р = 0,03) (табл. 3, 4).

Таблица 4. Распределение частот генотипов и аллелей A986S, R990G и Q1011E гена CaSR в группе детей с ХБП и гиперпаратиреозом по сравнению с группой гипопаратиреоза.

Известно, что прогрессирование вторичного гиперпарати­реоза у разных пациентов с ХБП происходит неодинаково, что в т. ч. может быть объяснено влиянием генетических факторов. Например, есть исследования, доказывающие связь между полиморфизмами гена рецептора витамина Д и уровнем ПТГ в крови пациентов на гемодиализе [10, 11].

С тех пор как был открыт CaSR и изучена его роль в подде­ржании уровня кальция в организме, начались исследования влияния полиморфизмов его гена на фосфорно-кальциевый обмен. Несмотря на количество этих исследований, полученные в них сведения довольно противоречивы. В одних показана связь между полиморфизмом A986S и уровнем кальция в крови у здоровых женщин, а также костной массой у женщин в периоде постменопаузы [12, 13], другие это опровергали [14]. В 2000 г. S. Yano et al. исследовали связь полиморфизмов гена CaSR с уровнем ПТГ в крови пациентов на диализе. Они выявили зависимость между повышенным уровнем ПТГ и двумя видами генотипов: RR-аллелем в полиморфизме R990G и С-аллелем в полиморфизме T/C 4 интрона [15]. Однако в 2002 г. K. Yokoyama et al. не нашли никаких различий между уровнями кальция, фосфата и ПТГ в крови пациентов с различными генотипами R990G [16]. В 2006 г. S. Corbetta et al., исследуя генотип боль­ных первичным гиперпаратиреозом в Италии, выявили, что гомо- и гетерозиготы с аллелем 990G, приводящим к замене аргинина на глицин во внутриклеточном концевом сегменте CaSR, демонстрировали более низкий уровень ПТГ и более высокий уровень экскреции кальция с мочой, что приводило к развитию нефролитиаза у больных [17]. Сходные данные получены и в японской популяции, в которой данный поли­морфизм встречается намного чаще, чем в европейской [18]. P.A. Eren et al. в 2009 г. отметил достоверную зависимость между повышенными уровнями ПТГ, кальция в крови и генотипами RR990 (аргинин вместо глицина) и QQ1011 (глутамин вместо глутаминовой кислоты) у пациентов с ХБП V стадии. Наиболее тяжелые формы вторичного гиперпаратиреоза отмечены у больных с сочетанием генотипов RR990 и QQ1011. Было сде­лано предположение, что молекула CaSR с глицином вместо аргинина во внутриклеточном концевом сегменте становится более чувствительной к ионам кальция [8].

Результаты нашего исследования согласуются с данными, полученными в работах итальянских и японских ученых [17, 18]. Как и у них, в группе наших пациентов выявлена зависи­мость между аллелем G в 990-м полиморфизме и пониженным уровнем ПТГ у больных ХБП. И так же как у них, в нашей работе не отмечено связи между уровнем ПТГ и полимор­физмом A986S. С другой стороны, нами не было выявлено зависимости между повышением уровня ПТГ и генотипами RR990 и QQ1011, что может быть связано с небольшой числен­ностью больных. В других работах исследуемые группы были более многочисленны (192 человека в исследовании P.A. Eren, 122 — в исследовании Sh. Yano).

Таким образом, результаты проведенного нами исследования позволяют говорить о существовании связи между полимор­физмом гена CaSR и нарушениями фосфорно-кальциевого обмена у больных ХБП. С аллелем G в 990-м полиморфизме ассоциированы более низкий уровень ПТГ в крови и склон­ность таких пациентов к гипопаратиреозу. Лечение с учетом наличия данного полиморфизма может быть более эффек­тивным для коррекции костно-минеральных нарушений у детей с ХБП.


Литература


1. Brown E.M., Gamba G., Riccardi D. et al. Cloning and characterization of an extracellular Ca2+-sensing receptor from bovine parathyroid. Nature 1993; 366: 575-580.
2. Aida K., Koishi S., Tawata M. et al. Molecular cloning of a putative Ca2+- sensing receptor cDNA from human kidney. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995; 214: 524.
3. Toribio R.E., Kohnl C.W., Capen C.C. et al. Parathyroid hormone (PTH) secretion, PTH mRNA and calcium-sensing receptor mRNAexpression in equine parathyroid cells, and effects of interleukin (IL)-1, IL-6, and tumor necrosisfactor-a on equine parathyroid cell function. J. Mol. Endocrinol. 2003; 3: 609.
4. Brown E.M., Macleod R.J. Extracellular calcium sensing and extracellular calcium signaling. Physiological Reviews. 2001; 81: 239.
5. Ростомян Л.Г., Рожинская Л.Я., Егшатян Л.М. Кальцимиметики — новый класс препаратов для лечения гиперпаратиреоза. Остеопороз и остеопатии. 2008; 2: 29—36.
6. Hebert S.C., Seidman C.E., Seidman J.G. Autosomal dominant hypocalcaemia caused by a Ca-sensing receptor gene mutation. Nature Genet. 1994; 8: 303.
7. Poliak M.R., Brown E.M., Chou Y.H. et al.: Mutations in the human Ca2+-sensing receptor gene cause familial hypocalciuric hypercalcemia and neonatal severe hyperparathyroidism. Cell. 1993; 75: 1297—1303.
8. Eren P.A., Turan K., Berber I. et al. The clinical significance of parathyroid 14. tissue calcium sensing receptor gene polymorphisms and expression levels in end-stage renal disease patients Clinical Nephrology. 2009; 72 (2): 114—121.
9. Cole D.E., Peltekova V.D., Rubin L.A. et al. A986S polymorphism of the calcium-sensing receptor and circulating calcium concentrations. 15. Lancet. 1999; 353: 112.
10. Yokoyama K., Shigematsu T., Tsukada T. et al. Apa I polymorphism in the vitamin D receptor gene may affect the parathyroid response in Japanese with 16. end-stage renal disease. Kidney Int. 1998; 53: 454—458.
11. Nagaba Y., Heishi M., Tazawa H. et al. Vitamin D receptor gene polymorphisms. affect secondary hyperparathyroidism in hemodialyzed patients. Am. J. Kidney Dis. 1998; 32: 464—469.
12. Cole D.E.C., Vieth R., Trang H.M. et al. Association between total serum calcium and the A986S polymorphism of the calcium-sensing receptor gene. Mol. Gen. Metab. 2001; 72:168—174.
13. Tsukamoto K., Orimo H., Hosoi T. et al. Association of bone mineral density 18. with polymorphism of the human calcium-sensing receptor locus. Calcif. Tissue Int. 2000; 66: 181—183.
14. Bollerslev J., Wilson S.G., Dick I.M. et al. Calcium-sensing receptor gene polymorphism A986S does not predict serum calcium level, bone mineral density, calcaneal ultrasound indices, or fracture rate in a large cohort of elderly women. Calcif. Tissue Int. 2004; 74: 12—17.
15. Yano S., Sugimoto T., Kanzawa M. et al. Association of calcium-sensing receptor gene with parathyroid hormone secretion in hemodialysis patients. Nephron. 2000; 85: 317—323.
16. Yokoyama K., Shigematsu T., Tsukada T. et al. Calcium-sensing receptor gene polymorphism affects the parathyroid response to moderate hypercalcemic suppression in patients with endstage renal disease. Clin. Nephrol. 2002; 57: 131—135.
17. Corbetta S., Eller-Vainicher C., Filopanti M. et al. R990G polymorphism of the calcium-sensing receptor and renal calcium excretion in patients with primary hyperparathyroidism. Eur. J. Endocrinol. 2006; 155: 687—692.
18. Yamauchi M., Sugimoto T., Yamaguchi T. et al. Association of polymorphic alleles of the calcium-sensing receptor gene with the clinical severity of primary hyperparathyroidism. Clinical Endocrinology. 2001; 55: 373—379.


Об авторах / Для корреспонденции


Молчанова М.С. – ассистент кафедры госпитальной педиатрии, ГБОУ ВПО “Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова” Минздравсоцразвития России.
E-mail: maria_molchanova@yahoo.com;
Тихомиров Е.Е. – старший научный сотрудник, ГУ “Научно-исследовательский институт вирусологии им/ Д.И. Ивановского” Минздравсоцразвития России, к.м.н.;
Быкова Л.П. – врач лаборатории клинической иммунологии, ФГУ “Российская детская клиническая больница” Минздравсоцразвития России, к.б.н.;
Молчанова Е.А. – врач-нефролог отделения по пересадке почки, ФГУ “Российская детская клиническая больница” Минздравсоцразвития России, к.м.н.;
Румянцев А.Л. – врач-нефролог отделения по пересадке почки, ФГУ “Российская детская клиническая больница” Минздравсоцразвития России, к.м.н.;
Валов А.Л. – заведующий отделением по пересадке почки, ФГУ “Российская детская клиническая больница” Минздравсоцразвития России, д.м.н.;
Эктов Д.Б. – врач-хирург отделения по пересадке почки, ФГУ “Российская детская клиническая больница” Минздравсоцразвития России;
Гаврилова В.А. – врач-нефролог отделения нефрологии, ФГУ “Российская детская клиническая больница” Минздравсоцразвития России, д.м.н.;
Юрасова Ю.Б. – заведующая отделением нефрологии, ФГУ “Российская детская клиническая больница” Минздравсоцразвития России, д.м.н.;
Петросян Э.К. – профессор кафедры госпитальной педиатрии, ГБОУ ВПО “Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова” Минздравсоцразвития России, д.м.н.


Похожие статьи


Бионика Медиа