Clinical relevance of determination of neutrophil gelatinase-associated lipocalin-2 in children with acute kidney injury


A.V. Eremeeva, V.V. Dlin, A.A. Korsunsky, N.M. Zaikova, E.D. Bondarenko, E.V. Kondrikova

1 FSAEI HE «First Moscow State Medical University n.a. I.M. Sechenov» of RMH; Moscow, Russia; 2 SAB «Scientific Research Clinical Institute of Pediatrics n.a. Academician Yu.E. Veltischev» FSBEI HE «Russian National Scientific Medical University n.a. N.I. Pirogov» of RMH; Moscow, Russia
Improvement of methods for diagnosis and prediction of acute kidney injury is associated with the identification and evaluation of new biomarkers associated with early stage acute kidney injury and independent of the filtration renal function. The article presents data on the evaluation of the role of neutrophil gelatinaseassociated lipocalin in the diagnosis of acute kidney injury. The results of a number of studies that demonstrate the reliable efficacy of NGAL as a biomarker for predicting the risk of developing acute kidney injury and renal tubular damage are analyzed. Detection of NGAL in the urine and blood can reflect the active damage of the renal tubules, predict a decrease in the glomerular filtration rate and, thereby, predetermine the progression of the disease. It has been established that blood and urine NGAL levels is a prognostically significant biomarker of the course of acute kidney damage of different etiology in both children and adults.

Острое повреждение почек (ОПП) – это синдром нарастающего по стадиям острого поражения почек: от минимальных изменений почечной функции до ее полной утраты. ОПП часто развивается у пациентов в критическом состоянии и, являясь в таких случаях независимым фактором риска смерти, связан с высокой смертностью. Несмотря на значительный прогресс в области медицинской науки и практики, на протяжении последних 30 лет высокая смертность продолжает оставаться в диапазоне от 28 до 90%. Частота летальных исходов зависит от возраста пациентов, этиологии и тяжести ОПП, характера основной и сопутствующей патологии, профиля отделения интенсивной терапии и ряда других факторов. Среди пациентов, нуждающихся в заместительной почечной терапии (ЗПТ), отмечаются максимальные показатели смертности, которые достигают 50–70% [10].

В современной клинической практике «золотым» стандартом в диагностике ОПП остается оценка динамики креатинина крови [11]. Однако повышение данного показателя зависит от многих факторов, поэтому он не информативен в первые часы развития ОПП. В связи с этим был проведен ряд исследований, посвященных определению маркеров ОПП, ассоциированных с ранней стадией ОПП и не зависящих от фильтрационной функции почек [12]. Обнаружение подобных биомаркеров позволило диагностировать синдром ОПП на ранних стадиях [13].

Биомаркеры – это соединения, которые продуцируются в канальцевом эпителии почек и в повышенных количествах выделяются в мочу при ОПП. К таким соединениям относятся цистатин-С, интерлейкин-18, молекула почечного повреждения-1 (КIМ-1) [14–16], Na+/H+обменник типа 3 (NHE-3), а также ряд ферментов, обычно локализующихся в щеточной каемке проксимальных канальцев и др., в т.ч. и нейтрофилжелатиназа-ассоциированный липокалин (липокалин-2, neutrophil gelatinase-associated lipocalin) [17]. Нейтрофил-желатиназа-ассоциированный липокалин (NGAL) обнаружен биологом L. Kjeldsen в 1993 г. [1]. Этот биомаркер имеет несколько названий: липокалин нейтрофилов (neutrophillipocalin – NL), липокалин-2 (lipocalin 2) и онкогенный белок 24p33 (oncogeneprotein 24p33). Липокалины – это белки, связывающиеся со специфическими рецепторами на поверхности клеток. NGAL представляет собой транспортный белок в виде мономера с молекулярной массой 25 kDa, гомодимер обладает массой м45 kDa, гетерогенные формы – 135 kDa. NGAL был назван так по месту первичного обнаружения (был выделен из супернатанта активированных нейтрофилов человека).

Липокалин-2 синтезируется в трубчатых эпителиальных клетках проксимального и дистального сегментов почки. Мономерные и гетеродимерные формы в основном производятся эпителиальными клетками, в то время как гомодимерные формы продуцируются активированными нейтрофилами [2]. При более подробных исследованиях выяснено, что, хотя NGAL действительно выходит в плазму из вторичных гранул активированных нейтрофилов, он может синтезироваться в различных органах и клетках. L. Kjeldsen и соавт. показали, что у здорового человека NGAL в крови не определяется либо имеется в небольшой концентрации в различных тканях или органах с активированными эпителиальными клетками [1]. Первые сведения о том, что NGAL может синтезироваться в почках, появились еще в 1989 г. – до того, как маркер был выделен из активированных нейтрофилов, после проведения серии исследований на мышах и крысах. Белок 24p3, являющийся мышиным гомологом липокалина-2, как оказалось, синтезируется именно в почках. При заражении вирусом SV40 синтез 24p3 в почках возрастал в 14–20 раз [3]. Позднее обнаружилось «драматическое» повышение синтеза NGAL в клетках проксимальных канальцев крысы как при нарушениях, связанных с индуцируемой реперфузией ишемией [4], так и в случаях поражения нефротоксическими соединениями [5]. На основании полученных данных сделан вывод, согласно которому у человека и лабораторных животных уровень NGAL резко возрастает в плазме, почках и в моче в ответ на почечные повреждения [6].

Механизм повышения NGAL при почечных повреждениях изучался на молекулярном уровне. Промоторная область, регулирующая экспрессию гена NGAL, имеет участок связывания с различными факторами, регулирующими транскрипцию, важнейшим из которых является NF-κB [7]. Центральную роль в обеспечении выживания поврежденных ренальных клеток и их дальнейшей пролиферации играет то, что фактор быстро активируется в почечных канальцах после острого повреждения почек (ОПП) и стимулирует транскрипцию гена NGAL, а также повышение его синтеза. Это говорит о таких функциях NGAL при развитии повреждений ренального эпителии, как восстановление эпителия и предотвращение дальнейшего развития ОПП [6, 8].

NGAL связывается с ферментом, называемым желатиназой Б нейтрофилов, известной как нейтрофильная коллагеназа IV типа или матриксная металлопротеиназа-9, ММП-9 относится к семейству железосодержащих протеолитических ферментов, которые синтезируются в большинстве тканей и при этом разрушают внеклеточный белковый матрикс клеток. Комплекс NGAL–MMП-9 (массой 92 kDA) встречается не только в различных тканях, но и в моче. В норме ММП-9 обеспечивает контролируемое ремоделирование соединительной ткани или обмен соединительного тканевого матрикса [4].

С помощью животных моделей показано, что NGAL стимулирует дифференцировку эпителия в эмбриональных ренальных тканях, способствуя перемещению стромальных интерстициальных клеток-предшественников на периферию развивающейся почки. Это приводит к дифференцировке мезенхимальных предшественников, образующих похожие на нефрон структуры, в которых затем экспрессируются специфические маркеры, характерные для клубочков, проксимальных канальцев, петель Генле и дистальных канальцев. Эти процессы стимулируются и регулируются различными клеточными сидерофорами, связывающимися с NGAL [6].

Также в культивируемых клетках собирательных трубок NGAL стимулирует преобразование эпителиальных клеток в тубулярные структуры. Однако способность NGAL индуцировать дифференцировку не ограничивается только эмбриональными ренальными клетками. Он способен стимулировать дифференцировку 4T1-Ras-трансформированных мезенхимальных опухолевых клеток, в которых в итоге появляются белковые маркеры, характерные уже для эпителиальных клеток [9]. Таким образом, при стимулировании определенным образом соответствующими сидерофорами NGAL в норме принимает важное участие в индукции формирования эпителиальных характеристик у ранее неэпителиальных клеток и влияет на преобразование структуры уже образовавшегося эпителия. При ОПП NGAL из плазмы крови поступает в почки, фильтруется и реабсорбируется в проксимальных канальцах. Доказано, что при повреждении ренальных канальцев происходит повышение уровня NGAL как в сыворотке (в 7–16 раз), так и в моче (в 25–1000 раз) [5, 18]. При ишемии, воспалении, стрессе, тубулярном некрозе почек источниками высоких плазменных уровней NGAL являются клетки иммунной системы (нейтрофилы, макрофаги и др.), гепатоциты, адипоциты, клетки предстательной железы, клетки почечных канальцев, а также клетки эпителия респираторного и пищеварительного тракта [7].

Несмотря на свободную фильтрацию NGAL-плазмы клубочками, он в большой степени реабсорбируется в проксимальных канальцах за счет эндоцитоза. Радиоактивно меченный (Йод125), NGAL, введенный в кровоток, затем обнаруживается в проксимальных канальцах, но практически не попадает в мочу, хотя и обнаруживается в ней в количествах, не превышающих 0,2% от введенной концентрации [19].

При ОПП NGAL синтезируется в дистальном нефроне. Четко показано, что при ОПП происходит быстрое и значительное повышение (в 1000 раз) синтеза мРНК, кодирующей NGAL, в восходящем колене петли Генле и в собирательных трубках. Это выяснилось при обнаружении места первичного ишемического повреждения почек (проксимальные канальцы), а также повышенных уровней белка NGAL, которые обнаруживаются в постишемических почках и локализуются именно в лизосомальном компартменте поврежденных проксимальных канальцев.

Прямое измерение уровней NGAL в почечной вене при ОПП показало, что в результате такого массированного синтеза NGAL именно в дистальном нефроне и последующей его секреции именно «ренальый» NGAL и составляет наибольшую фракцию NGAL в моче. Синтезируемый в почках пул NGAL в кровообращение не поступает, а экскретируется в мочу. Любая экскреция NGAL в мочу происходит, только когда она связана с повреждением проксимальных ренальных канальцев (что предотвращает реадсорбцию NGAL) и/или с повышением синтеза NGAL в почках de novo [19].

Было обнаружено, что введение мышам перед острым ишемическим тубулярным повреждением комплекса NGALсидерофор–железо защищало эпителиальные канальцевые клетки и смягчало падение почечных функций. При этом такой NGAL-сидерофорный комплекс уменьшал апоптоз почечного эпителия после его ишемического повреждения. Таким образом, при ОПП повышенный плазменный NGAL абсорбируется в проксимальных канальцах и в мочу не секретируется, а «ренальный» NGAL синтезируется в тонких восходящих окончаниях петли Генле и в собирательных трубках и поступает в мочу [19].

В работах M. Haase и J. Mishra показано, что концентрация NGAL как в моче, так и в плазме крови увеличивается пропорционально тяжести и длительности почечного повреждения. Маркер определяется как в сыворотке крови, так и в моче [5, 20]. Повышенный синтез NGAL в деградирующих тканях позволяет считать, что этот белок принимает участие, с одной стороны, в процессе апоптоза, с другой – в повышении выживаемости поврежденных клеточных структур.

При различных типах нормального и нарушенного связывании NGAL с MMП-9, которое может регулироваться взаимодействием с катионами железа, может происходить:

1) восстановление поврежденного эпителия (предполагают, что это одна из «нормальных» функций NGAL как белка острой фазы воспаления);

2) стимулирование злокачественного роста и метастазирования;

3) ремоделирование атеросклеротических бляшек;

4) ремоделирование миоцитов при ишемических повреждениях миокарда.

Во всех этих случаях уровни NGAL в плазме и/или в моче повышаются.

uNGAL как маркер острой фазы воспаления

При инфекциях и/или воспалении (особенно при воспалении, связанном с бактериальными инфекциями) плазменные уровни NGAL повышаются весьма быстро. Измерение сывороточного NGAL позволяет отличать бактериальные инфекции от вирусных. При вирусных инфекциях уровни NGAL в сыворотке составляли 9,78 +/-45,30 мкг/л, при бактериальных – 404,14 +/-355,02 мкг/л, в плазме – 47,81 +/-18,18 и 45,46 +/-194,32 мкг/л соответственно. Измеренные в тех же условиях уровнями С-реактивного белка (СРБ) хорошо коррелировали с уровнями NGAL [21]. Позднее выяснилось, что исходно повышенные при поступлении уровни NGAL у педиатрических пациентов с инфекциями у большинства (89%) снижались уже к 3–4-му дню, в то время как уровни СРБ к этому времени снижались только у 17% больных. В целом с длительностью проявления симптомов инфекции коррелировали уровни СРБ, но не уровни NGAL. Полагают, что NGAL значительно повышается при активно текущих инфекциях [22]. Однако плазменные уровни NGAL повышаются и при острой фазе воспаления, не связанного с инфекциями, вызываемого, например, инъекцией мышам дексаметазона. При этом NGAL, как и большинство острофазных белков, синтезируется в печени [23].

Одной из нормальных функций NGAL является его участие в острофазном ответе на воспаление. В ряде экспериментальных работ показано, что NGAL может являться переносчиком комплекса «железо–сидерофор» – небольших органических молекул, продуцируемых организмами бактерий и человека. Связываясь с комплексами «железо–сидерофор», NGAL может включаться в антибактериальную защитную систему организма и ограничивать рост бактерии путем отделения железа и лишения бактерии этого важного элемента [19]. Для поглощения необходимых бактериям катионов железа Fe3+ микробные клетки обладают специальным механизмом. В аэробных условиях при рН=7,0 железо представлено в виде слаборастворимого гидроксидного комплекса Fe3+. Для обеспечения себя железом микроорганизмы выделяют специальные соединения, переводящие железо в растворимую форму. Эти соединения (т.н. сидерофоры) связывают ионы Fe3+ в комплекс и в таком виде транспортируют его внутрь микробной клетки. NGAL способен связывать бактериальные сидерофоры, нагруженные катионами железа, и ограничивать рост бактерий [24]. Ярким доказательством бактериостатической роли NGAL являются трансгенные мыши, лишенные гена, кодирующего NGAL, и тем самым – белка NGAL. Эти мыши легко инфицировались различными грамотрицательными бактериями и быстро погибали. Интересно, что NGAL может повышаться у инфицированных пациентов с низким, даже не поддающимся подсчету количеством нейтрофилов, связанным с лейкемией (как до начала лечения, так и уже подвергнутой терапии). Это указывает на то, что при инфекциях источником NGAL являются не только нейтрофилы. Действительно, уровни сывороточного NGAL (s-NGAL) очень слабо коррелируют с количеством нейтрофилов у критических больных [25].

ОПП может возникать при гемолитическом уремическом синдроме (ГУС), связанном с диареей. В исследовании, охватившем множество научных центров, показано, что у детей со связанным с диареей ГУС, уровни u-NGAL, измеренные в первые дни госпитализации, с большой чувствительностью предсказывали тяжесть ОПП и необходимость диализа. Наблюдение проводилось за 34 детьми с ГУС. Все пациенты были разделены на 2 группы, согласно уровням u-NGAL: <200 и ≥200 нг/мл. Тяжесть ГУС была сходной в обеих группах пациентов. Двадцать восемь (58%) пациентов имели повышенную экскрецию u-NGAL. Однако пациенты с повышенными уровнями u-NGAL имели более высокие концентрации азота мочевины в крови и сывороточного креатинина и нуждались в диализе. Десять (29%) человек нуждались в диализе в течение пяти дней после госпитализации. Авторами данного исследования был сделан вывод, согласно которому у большинства пациентов с ГУС, связанным с диареей, отмечается повышение экскреции u-NGAL, что свидетельствует об имеющихся повреждениях ренального тубулярного эпителия. Уровни u-NGAL ниже 200 нг/мл в течение пяти дней госпитализации могут быть дополнительным маркером, свидетельствующим о менее тяжелом поражении почек [26].

NGAL при трансплантации почки

Ранняя диагностика осложнений, возникающих при трансплантации почки (отторжение трансплантата, инфекционные осложнения, побочное действие иммуносупрессивных средств, рецидив гломерулонефрита в трансплантате и развитие его de novo, урологические и сосудистые осложнения), согласно проведеным исследованиям, возможна с помощью определения NGAL.

Haase-Fielitz и соавт. обследовали 33 пациента, из которых 20 пациентам была выполнена трансплантация трупной почки, 13 – от живого донора. Авторы исследования определяли NGAL, креатинин, гемоглобин, уровень глюкозы крови как до операции, так и через 12 часов, 24, через 48 и 72 часа после трансплантации. Также они оценивали функции почки и необходимость проведения диализа в течение недели после операции. По результатам исследования у 6 пациентов отмечено отсроченное восстановление почечной функции, в связи с чем им проведен гемодиализ в течение первой недели после трансплантации. У 9 пациентов было замедленное восстановление функции трансплантата, к 7-м суткам отмечено снижение сывороточного креатинина. У 23 пациентов с выявленным снижением сывороточного креатинина более чем на 70% наблюдалось быстрое восстановление функции трансплантата без проведения заместительной почечной терапии (ЗПТ).

У пациентов с отсроченным восстановлением функции трансплантата NGAL и креатинин крови были значительно выше, чем у других пациентов. При немедленном восстановлении функции трансплантата различий по уровню креатинина не было, однако динамика NGAL у них была различной. Таким образом, авторы показали, что NGAL служит более точным маркером острого повреждения почек, чем динамика сывороточного креатинина [20, 27, 28]. Вместе с тем плазменная концентрация NGAL в первые сутки не позволяет отличать больных с отсроченным восстановлением функции трансплантата. Проведенные исследования показали, что наиболее информативно определение s-NGAL через 24 часа после трансплантации почки. Измерение u-NGAL позволяет выделить пациентов, которые нуждаются в проведении гемодиализа в течение первой недели. Наиболее информативным был уровень NGAL на исходе первых суток после трансплантации почки. Lebkowska и соавт. в своем исследовании также обнаружили, что снижение NGAL при восстановлении почечной функции происходит быстрее, чем нормализация сывороточного креатинина крови [29].

I.E. Hall и соавт. в проспективном когортном мультицентровом исследовании обнаружили, что определение u-NGAL в первые несколько суток после трансплантации трупной почки позволяет выявить пациентов с быстрым, медленным и отсроченным восстановлением функции трансплантата. Динамика этого маркера дала возможность разделить больных на нуждающихся в проведении гемодиализа в течение первой недели и тех, кому возможно проведение данной операции в более поздние сроки (до 3 месяцев) [14, 30].

При проведении 10 наблюдательных исследований было обнаружено, что определение NGAL в плазме крови или в моче позволяет диагностировать субклинические формы ОПП, при этом повышение NGAL не коррелировало с динамикой креатинина крови. Таким пациентам чаще проводили заместительную почечную терапию, и, к сожалению, у них возрастал риск неблагоприятных исходов [31]. Данные исследования показали возможность использования NGAL на субклинических стадиях ОПП, когда общепринятые клинические и диагностические критерии не информативны.

В связи с тем что NGAL в большей степени выделяется с мочой, а не поступает в систему кровообращения, корреляций между уровнем сывороточного NGAL и степенью выраженности отсроченного восстановления функции трансплантата получено не было. Таким образом, основным результатом проведенных исследований можно считать полученные данные о том, что плазменный уровень NGAL может служить ранним маркером острого повреждения трансплантата и показанием к проведению сеансов гемодиализа.

u-NGAL – предиктор посттравматического ОПП

В одном из исследований 31 взрослому пациенту с множественными травмами, не имевшему предшествовавших сердечных или почечных заболеваний, проводили измерение уровней u-NGAL. Измерения проводились при поступлении пациентов в стационар, через 24 и 48 часов. Были получены данные, согласно которым пограничный уровень u-NGAL, измеренный в первый день после поступления и предсказывавший развитие ОПП при множественных травмах, составил >25 нг/мл и имел чувствительность 0,91, специфичность – 0,95. У пациентов, в течение пяти дней развивших ОПП, уровни u-NGAL при поступлении составили 155,5 (50,5–205,9) нг/мл (против 8,0 [5,7–17,7] нг/мл у пациентов без ОПП) и персистировали на этом уровне в течение 2 дней [32].

NGAL – ранний маркер развития ОПП при операциях, связанных с применением аппарата искуственного кровообращения (АИК)

Согласно данным научной медицинской литературы, у 10% больных, которым выполняют кардиохирургические операции с использованием АИК, наблюдается почечная дисфункция [33], которая проявляется повышением сывороточного креатинина до уровня более 2 мг. Пятой части пациентов, у которых наблюдается ОПП, требуется проведение заместительной поддерживающей терапии. У этих пациентов летальность достигает 20%, а среди больных, которым проводят диализ, частота летального исхода доходит до 75%.

Клиническая ценность u-NGAL впервые была доказана у пациентов детского возраста, которым выполняли кардиохирургические операции. Его участником стал 71 ребенок после оперативной коррекции врожденных пороков сердца. По результатам этого исследования выяснилось, что u-NGAL обладает высокой прогностической ценностью в отношении риска развития ОПП уже через 2 часа после окончания операции с АИК, особенно при осложнениях, приводящих к ишемии почек [5].

В исследовании J.L. Koyner и соавт. было показано развитие ОПП после длительного АИК. Из 72 взрослых пациентов у 47% развилось ОПП. Уровни u-NGAL, измеренные через 6 часов, предсказали развитие ОПП [34].

M. Bennettа и соавт. выполнили обследование 196 пациентов, у 51% из которых после аортокоронарного шунтирования (АШК) развилось ОПП. Через 2 часа после операции до повышения концентрации креатинина в сыворотке крови уровень u-NGAL возрос в 15, а через 4–6 часов – в 25 раз. Степень повышения u-NGAL коррелировала с тяжестью и длительностью ОПП, а также потребностью в остром гемодиализе и летальностью больных [35, 36].

В других крупных исследованиях ретроспективной оценки отдаленных результатов кардиохирургических вмешательств также была подтверждена высокая прогностическая значимость NGAL при определении данного маркера в крови и моче [14, 30].

Заключение

Представленные результаты исследований демонстрируют достоверную эффективность определения NGAL в качестве биомаркера не только для прогнозирования риска развития ОПП разной этиологии как у детей, так и у взрослых, но и для раннего обнаружения ренальных тубулярных повреждений. Открытие причин и механизмов повышения уровней NGAL в сыворотке и в моче привело исследователей к предположению, будто NGAL может стать таким же эффективным маркером острого поражения почек, как и тропонин для инфаркта миокарда.С учетом простоты и доступности метода его можно рекомендовать к определению у пациентов с рисками развития ОПП.


About the Autors


Eremeeva A.V. – PhD in Medical Science, Associate Professor at the Department of Pediatrics and Children’s Infectious Diseases FSAEI HE "First Moscow State Medical
University n.a. I.M. Sechenov" of RMH; Moscow, Russia. E-mail: alinaeremeeva@yandex.ru
Dlin V.V. – Doctor of Medical Sciences, Professor, Deputy Director for Scientific Work SAB SRCI of Pediatrics n.a. Academician Yu.E. Veltischev FSBEI HE "RNSMU n.a.
N.I. Pirogov" of RMH; Moscow, Russia. E-mail: vvdlin@mail.ru
Korsunsky A.A. – Doctor of Medical Sciences, Professor, Head of the Department of Pediatrics and Children’s Infectious Diseases FSAEI HE "First Moscow State Medical
University n.a. I.M. Sechenov" of RMH; Moscow, Russia. E-mail: dr_kaa@mail.ru
Zaikova N.M. – PhD in Medical Science, Teaching Assistant at the Department of Pediatrics and Children’s Infectious Diseases FSAEI HE "First Moscow State Medical
University n.a. I.M. Sechenov" of RMH; Moscow, Russia. E-mail: nataliazaikova@mail.ru
Bondarenko E.D. – Teaching Assistant at the Department of Pediatrics and Children’s Infectious Diseases FSAEI HE "First Moscow State Medical University n.a. I.M.
Sechenov" of RMH; Moscow, Russia. E-mail: alenkabond@gmail.com
Kondrikova E.V. – PhD in Medical Science, Associate Professor at the Department of Pediatrics and Children’s Infectious Diseases FSAEI HE "First Moscow State Medical
University n.a. I.M. Sechenov" of RMH; Moscow, Russia. E-mail: e.kondrikova@mail.ru


Similar Articles


Бионика Медиа